2022 Fiscal Year Research-status Report
The use of nucleic acid aptamers as a removable masking agent for the controlled polymer modification of enzymes
| Project/Area Number |
21K06522
|
|---|
| Research Institution | Gihu University of Medical Science |
|---|
Principal Investigator |
笹井 泰志 岐阜医療科学大学, 薬学部, 教授 (60336633)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
磯野 蒼 岐阜医療科学大学, 薬学部, 助教 (50880481)
近藤 伸一 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (90240944)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | アプタマー / 酵素阻害剤 / トリプシン / 酵素ー高分子コンジュゲート |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
高分子による酵素の修飾は、酵素の安定性改善、物性改善、および活性のON/OFF制御や環境応答性付与等の機能化に利用されている。一方で、酵素を化学的に高分子修飾すると、基質分子の酵素活性部位へのアクセスが修飾高分子によって妨害されるなどが原因で、酵素活性の低下が一般的に認められる。本研究では、高分子修飾する際の酵素活性部位のマスク剤として、酵素活性部位に対するアプタマーを用いる新たな高分子修飾法の開発を目的とするものである。
令和４年度は、前年度より継続している課題として、酵素としてウシトリプシンを用い、そのアプタマー（Apt）の酵素阻害特性を詳細に検討した。Michaelis-Menten式に基づき、速度論的解析を実施したところ、使用したAptによる混合型阻害様式が示唆され、酵素阻害定数は、116 nMであった。また、Aptによる阻害時間にかかわらず、任意のタイミングでAptに対する相補的配列を有する一本鎖DNA（cApt）を添加することにより、トリプシン活性を回復させることができた。これは、AptとcAptを組み合わせることで酵素活性のOFF/ON制御が可能であることを示唆する結果である。Aptをマスク剤とするトリプシンの高分子修飾について、修飾高分子にpoly(N-isopropylacrylamide)を用いて検討したところ、Aptを用いない系と比較して、トリプシンの活性低下を抑制できることが示された。追加での検討が必要な状況ではあるが、アプタマーをリムーバブルマスク剤とすることで効果的に酵素の高分子修飾が可能である初期的知見を得ることはできた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定では、再利用可能なアプタマーの合成およびウシトリプシンで得られた知見を基にPEG化L-asparaginase合成への適用を検討する予定であったが、令和3年度からの継続していた検討に時間を要し、実施できなかった。一方、アプタマーをマスク剤とするウシトリプシンの高分子修飾が実施でき、酵素の高分子修飾用マスク剤としてのアプタマーの有効性を示すことができ、令和5年度の検討をスムーズに展開できるものと考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究計画では、アプタマーを再利用可能にすること、および、アプタマーによるマスク領域の制御を目的に、刺激応答性高分子とアプタマーのコンジュゲート合成を予定していた。令和4年度に検討を進めたが、アプタマーの高分子修飾が想定より困難であることが分かった。一方、アプタマーを高分子とのコンジュゲートとしなくても、一定の保護効果があることが分かった。そこで、令和5年度は、アプタマーをマスク剤とするL-asparaginaseのPEG化を優先課題とし、アプタマーの高分子とのコンジュゲート合成は並行して検討することにする。
L-asparaginaseの活性部位に対するアプタマーについては、受託合成サービスを利用して入手予定である。候補アプタマーの中から、In silico解析により、マスク剤として適当なアプタマーを選定する。そのアプタマーをリブ―バブルマスク剤とするPEG化を実施する。L-asparaginaseについてはPEG化製剤が入手可能であるので、アプタマーを利用して合成下PEG化L-asparaginaseと構造的特性、活性低下率、安定性等の違いを比較評価し、アプタマーをリムーバブルマスク剤として合成したPEG化L-asparaginaseの特性を明らかにし、本酵素ー高分子コンジュゲート合成法の有用性を総括する。
|
| Causes of Carryover |
R4年度に予定していたの研究成果の論文投稿ができなかったことが未使用金発生の主な理由である。一方、物品費等が当初予定していた価格より高騰しており、研究費は不足気味である。未使用額については、最終年度の研究の進み具合により、不足している物品費や成果発表に配分する予定である。
|
