RecQ4が制御する新たなDNA修復経路選択機構の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06551
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 津山 崇 東邦大学, 薬学部, 講師 (70436096)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: RecQ4 / DNA二本鎖切断 / 非相同末端結合 / 相同組換え / DNA修復

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、DNA二本鎖切断（double-strand break: DSB）修復機構を分子レベルから解明するため、DSB修復経路に関与するRecQ4の機能解析をおこなっている。昨年度に引き続き、RecQ4と相互作用することが知られているHR関連タンパク質（MRE11）やNHEJ関連タンパク質（Ku70、Ku80）の組換えタンパク質の作製をおこなった。MRE11については組換えタンパク質の作製が完了し、現在RecQ4-Nとの相互作用について解析をおこなっている。まず、MRE11の組換えタンパク質が1本鎖環状DNAに対しエンドヌクレアーゼ活性を示すこと、二本鎖DNAとの結合活性を有することが確認された。そこで、これらの活性に対するRecQ4-Nの影響を調べたところ、RecQ-Nの存在下でMRE11のエンドヌクレアーゼ活性およびDNA結合活性が抑制されることが観察された。また、MRE11とRecQ4-Nが直接結合することが確認された。Ku70については、RecQ4-Nが結合するC末端領域のうち、SAPドメインを欠失させた組換えタンパク質の作製が完了した。Ku80については大腸菌での発現用プラスミドの作製、組換えタンパク質の発現と精製が完了している。またこれまでに申請者は、RecQ4-NのNHEJに対する阻害作用に、ATMキナーゼが関与することを示唆する結果を得ている。そこで、ATMによるRecQ4-Nのリン酸化がNHEJやHRに対する阻害作用に関与するか調べるため、RecQ4-Nに存在する推定リン酸化部位をすべてアラニンに置換した非リン酸化型変異体（RecQ4-N 5A）および、すべてグルタミン酸に置換した疑似リン酸化型変異体（RecQ4-N 5D）の組換えタンパク質を作製した。今後、作製したこれらの組換えタンパク質を用いて、RecQ4-Nの機能を詳細に解析していく予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、DSB修復におけるRecQ4-Nの作用メカニズムについて詳細に解析することを目的とし、組換えタンパク質を用いた生化学的解析と遺伝子導入培養細胞を用いた解析を組み合わせながら研究を進めていくことを計画している。必要となる組換えタンパク質はほぼすべて作製が完了しており、すでにそれらを用いた物理的・機能的相互作用の解析を開始している。培養細胞を用いた解析については、昨年度作製したRecQ4-N発現誘導株を用いた解析を進めているところである。

Strategy for Future Research Activity

作製した組換えタンパク質間の物理的・機能的相互作用について解析を進めるとともに、アフリカツメガエル卵抽出液を用いた解析を開始する。卵抽出液へDNA傷害剤とともに精子由来DNAを加えると、各修復関連タンパク質のDNA傷害依存的なクロマチン結合が観察される。そこで、RecQ4-Nを添加したときのMRE11やCtIP、およびその下流で機能するRPAやRad51のクロマチン結合の変化について解析し、RecQ4-NがHRのどの段階へ影響を与えるのか明らかとする。また、同様にRecQ4-N 5Aまたは5Dを添加したときの各タンパク質のクロマチン結合を調べ、ATMによるリン酸化の影響を明らかとする。培養細胞を用いた解析では、RecQ4-N発現誘導時の細胞増殖への影響や、DNA傷害剤に対する感受性の変化、各修復関連タンパク質のDSB部位への局在の変化などについて解析し、RecQ4-NによるNHEJやHRへの影響を明らかとすることでDSB修復におけるRecQ4の役割の解明を目指す。