2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the pathogenetic mechanisms of congenital diseases caused by the mutations in biosynthetic enzymes of heparan sulfate
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21K06552
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
山田 修平 名城大学, 薬学部, 教授 (70240017)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水本 秀二 名城大学, 薬学部, 准教授 (40443973)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ヘパラン硫酸 / EXTL3 / 生合成 / 遺伝病 / ノックアウトマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【実験１】組換えタンパク質の解析：グリコサミノグリカン生合成酵素の１つであるキシロース転移酵素について、患者で見つかっている変異型酵素タンパク質の組換え体を作製し、酵素活性の測定を行い、野生型と定量的な比較を行なった。活性の低下が確認でき、学会で成果を発表した。
【実験２】患者由来の細胞の解析： EXTL3変異患者由来の不死化した細胞を培養して大量に増やし、ここからグリコサミノグリカン鎖を精製し、その含有量、二糖組成、鎖長を調べ、健常人由来の細胞のデータと比較した。
【実験３】T細胞特異的Extl3 ノックアウト（KO）マウスの解析： T細胞特異的Extl3 コンディショナルKOマウスを作製し、T細胞分化への影響を調べた。マウスから血球を採取し、フローサイトメトリーで解析することにより、CD3、CD4、CD8などの細胞表面抗原の発現を調べ、同腹子の野生型やヘテロ型マウスと比較した。T細胞分化に遅れがあることを発見し、学会で成果を発表した。
【実験４】脳特異的Extl3 KOマウスの解析：神経細胞で特異的にEXTL3を欠損したコンディショナルKOマウスを作製し、脳の発達への影響を調べた。オープンフィールド試験、Y-迷路試験、高架式十字迷路試験、新奇物体認識試験を実施し、同腹子の野生型やヘテロ型マウスと比較し、短期および物体認知記憶などの脳機能への影響を検証した。今のところ、明確な差は見られていない。途中経過を学会発表した。
また、EXTL3ではないが、グリコサミノグリカン生合成酵素の１つであるガラクトース転移酵素IIについて、欠損ゼブラフィッシュを作成し、その表現型の解析を行って、学会で報告した。さらに、これらグリコサミノグリカン生合成酵素変異に基づく遺伝病についての総説論文を作成し、発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ほぼ予定通りであるが、コロナ禍の影響で、海外の学会に参加できず、情報収集が不十分である。細胞の不死化についても、複数の患者のものを用意したいが、海外とのやりとりがうまくできず、進んでいない。T細胞特異的Extl3KOマウスについては、期待していたような差異が見られたが、脳特異的Extl3 KOマウスについては、コントロールとの間で明確な差は見られていない。マクロなレベルでは差が見えにくいのかもしれない。
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| Strategy for Future Research Activity |
新型コロナウイルス感染の影響が弱まってきたら、積極的に学会に参加し、新しい情報を得る。グリコサミノグリカン生合成酵素変異に基づく遺伝病で見つかっている変異については、引き続き組換え体タンパク質を作成し、酵素活性の測定を行なっていく。患者由来の不死化した細胞を使った解析に関しては、HSの関与がよく知られているシグナル伝達経路として、繊維芽細胞増殖因子を介したErkのリン酸化、骨形成タンパク質を介したSmadのリン酸化などについて調べ、HSの欠損によって、どのシグナル伝達経路が影響を受けているのかを調べる。脳特異的Extl3 KOマウスにおいては、行動観察で差が見られていないので、ミクロなレベルでの実験を進める。つまり、脳の免疫染色や糖組成分析などを行って、生化学的な解析を進めることで打開策を図る。T細胞特異的Extl3KOマウスについても、生化学的な解析を行い、データを集め、論文作成につなげたい。
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Research Products
(20 results)
