2021 Fiscal Year Research-status Report
A replicon-based screen of yellow fever virus host factors: Toward generation of highly productive virus-producer cell lines
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21K06571
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
齊藤 恭子 国立感染症研究所, 細胞化学部, 主任研究官 (70235034)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山地 俊之 国立感染症研究所, 細胞化学部, 室長 (50332309)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 黄熱ウイルス / レプリコン / 宿主因子 / ゲノムワイドスクリーニング / 複製 / ワクチン産生細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
代表者はこれまでに、黄熱ウイルス（YFV）17D株のRNA複製能をレポーター活性で評価できるサブゲノミックレプリコンを構築している。本研究では、当該レプリコンを用いたゲノムワイドスクリーニングによって、YFVの複製に関与する宿主因子を見出すことにより、YFV17D高生産性Vero細胞を作出することを目標としている。また当該細胞を用いて、YFVのゲノム複製機構の手がかりも得ることも目的としている。
昨年度までに、YFV17Dのサブゲノミックレプリコンが持続的に複製されるVero細胞（レプリコン細胞）を樹立した。レプコンは構造遺伝子の代わりにGFP融合ゼオシン耐性遺伝子をコードしているので、レプリコン細胞では複製をGFPの発現でモニターすることができる。今年度は、スクリーニングの準備として、レプリコン細胞を使って複製能の亢進を検出することができるか、STAT1阻害剤フルダラビンを用いて調べた。STAT1はインターフェロンシグナルによる抗ウイルス応答に関与しているため、その阻害はウイルス複製を亢進させる方向に働くと考えた。レプリコン細胞をフルダラビンで処理したところ、GFP蛍光強度およびレプリコンRNAレベルが増加したことから、レプリコン細胞によって複製能の亢進を実際にモニターできることがわかった。また、今後レプリコン細胞を用いて実験していくための基礎データを得るため、当該細胞における複製中間体である二本鎖RNAとウイルスタンパク質の分布をYFV17D感染細胞と比較した。レプリコン細胞における両者の分布パターンは感染細胞のパターンとよく似ていることが明らかになり、レプリコン細胞が感染時の複製を反映していることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウイルス感染症のパンデミックにより、勤務先で始まったSARS-CoV-2関連業務に従事しており、研究時間が大幅に削減されたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
レプリコン細胞にCas9を発現した株はすでに作製済みであるので、ゲノム編集活性の高い細胞株を選別し、レンチウイルスベースのCRISPR/Cas9 single guide RNA（sgRNA）機能欠損型ライブラリ（GeCKO v2.0 library）を導入する。FACSにより、GFP蛍光の高い集団を分離して濃縮されたsgRNA領域配列を決定し、YFV17Dの複製能を亢進させる宿主因子候補を見出す予定である。
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| Causes of Carryover |
すでに持っていた試薬等を使って進めていたため、研究費使用開始が遅れ、2022年から試薬等の購入を始めた。年度末納品等にかかる支払いが、令和４年４月１日以降となったため、次年度使用額が生じた。当該支出分については次年度の実支出額に計上予定である。遅れている計画については2022年度に精力的に進めていき、研究費の適正な使用に努める予定である。
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