2022 Fiscal Year Research-status Report

A replicon-based screen of yellow fever virus host factors: Toward generation of highly productive virus-producer cell lines

Research Project

Project/Area Number	21K06571
Research Institution	National Institute of Infectious Diseases
Principal Investigator	齊藤恭子国立感染症研究所, 細胞化学部, 室長 (70235034)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山地俊之国立感染症研究所, 細胞化学部, 室長 (50332309)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	黄熱ウイルス / レプリコン / 複製 / 宿主因子
Outline of Annual Research Achievements	代表者はこれまでに、黄熱ウイルス（YFV）17D株のRNA複製能をレポーター発現で評価できるサブゲノミックレプリコンを構築している。本研究では、当該レプリコンを用いて、①YFVの複製に関与する宿主因子を見出すことにより、YFV17D高生産性Vero細胞を作出すること、②YFVのゲノム複製機構の手がかりを得ることを目的としている。これまでにYFV17Dのサブゲノミックレプリコンが持続的に複製されるVero細胞（レプリコン細胞）を樹立し、今年度はその性状解析に関する論文を発表した。レプリコンは構造遺伝子の代わりにGFP融合ゼオシン耐性遺伝子をコードしているので、レプリコンの複製をGFP蛍光でモニターすることができる。Vero細胞以外にヒト肝がん由来Huh7.5.1-8細胞でも同様のレプリコン細胞を作製し、特性解析を行ったところ、当該レプリコン細胞はVeroレプリコン細胞よりも抗ウイルス薬剤に対する感受性が高く、抗ウイルス薬物スクリーニングに有用であることがわかった。またヒト由来という点は遺伝学的スクリーニングにもメリットがあり、今後はVeroとHuh7.5.1-8の2種のレプリコン細胞を補完的に使用していくのが良いと考えられた。また、YFV感染がもたらす細胞内構造変化をアポダイズド位相差・蛍光顕微鏡で解析したところ、感染に特徴的なオルガネラ膜の時間変化を捉えることができた。今後、複製に関わる膜構造の形成因子を解析する際には、当該顕微鏡を用いたイメージングが有用であると考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 業務および別テーマの研究活動に時間を割く必要があり、本研究に割り当てた時間がやや減少したため。
Strategy for Future Research Activity	レプリコン細胞にレンチウイルスベースのCRISPR/Cas9 single guide RNA（sgRNA）機能欠損型ライブラリを導入し、YFV17D の複製能を亢進または低下させる宿主因子を探索する。また、レプリコン細胞を薬物スクリーニングに供する検討も始める。YFV感染細胞における特徴的な膜構造変化に関与する宿主因子の解析を進める。
Causes of Carryover	既存試薬等を使って進めていたため、研究費使用開始が遅れた。また、年度末納品等にかかる支払いが、令和5年4月1日以降となったため、次年度使用額が生じた。当該支出分については次年度の実支出額に計上予定である。遅れている計画については2023年度に精力的に進めていき、研究費の適正な使用に努める予定である。