2022 Fiscal Year Research-status Report

Identification of physiological substrates of osmotic stress-responsive ubiquitin ligase using genome editing, and its involvement in colitis

Research Project

Project/Area Number	21K06595
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	金子雅幸長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 教授 (10322827)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	高田修治国立研究開発法人国立成育医療研究センター, システム発生・再生医学研究部, 部長 (20382856)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	ユビキチンリガーゼ / RNF183 / 近位ビオチン標識法 / ノックインマウス / NKCC1 / BioID / 高浸透圧 / ユビキチン
Outline of Annual Research Achievements	RNF183遺伝子にビオチンリガーゼBioID2とFLAGタグをゲノム編集によってノックインしたマウスを作出した。ノックインしたマウスからRNF183を発現する細胞を単離するため、蛍光タンパク質tdTomatoとBioID2-3×FLAG-RNF183との間をT2A配列でつなぐことで、tdTomatoとBioID2-3×FLAG-RNF183を別々に発現させることにした。ノックインに成功したマウスを得たため、今後の解析のために現在交配中である。 RNF183によるNKCC1のユビキチン化部位を同定するため、NKCC1のN末端欠失変異体およびC末端欠失変異体を作製し、ユビキチン化部位の同定を行った。その結果、NKCC1のC末端欠失変異体においてRNF183による分解が阻害されたことから、RNF183がNKCC1のN末端をユビキチン化することが示唆された。さらに、C末端のユビキチン化部位であるリジン残基を変異させた細胞も複数作製した。 RNF183の生理的基質を同定するため、RNF183を発現するマウス集合管細胞mIMCD-3に、ポリユビキチン鎖に高い親和性を持つTUBEを安定発現する細胞を樹立した。さらに、この細胞のRNF183をノックアウトした細胞も樹立した。この細胞を用いて、TUBEに結合したタンパク質からRNF183依存的なユビキチン化タンパク質を質量分析により同定することを現在試みている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年度からのノックインマウスのマイクロインジェクションの遅れにより、ノックインマウスの解析は全体的に遅れていたが、本年度分はノックインマウスの作出まで順調に進行した。また、細胞の解析についても、BioID2のノックイン細胞からTUBEシステムを用いた細胞に切り替えることができたため、昨年度の遅れを取り戻すことができた。
Strategy for Future Research Activity	BioID2のノックインマウスとTUBE発現細胞を用いて、RNF183の生理的基質の同定を個体および細胞レベルで進める。
Causes of Carryover	昨年度のノックインマウスの作出が遅れたために全体のスケジュールが後ろ倒しになり、ノックインマウスの解析に関する費用を次年度に繰越した。