プロテオーム解析に基づく抗血小板薬の薬効指標の確立および薬動力学解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06709
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 山本 康次郎 群馬大学, 大学院医学系研究科, 教授 (70174787)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒木 拓也 群馬大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (00568248)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 血小板 / Talin

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、血小板凝集能を変化させた多血小板血漿をADP刺激した後のプロテオーム解析を行い、血小板凝集能を定量的に反映するタンパク質を探索する。保存検体でも安定に存在する指標タンパクを見出すことにより、臨床現場において血小板凝集能を容易に評価できるようになる。また、抗血小板薬の薬動力学解析が可能になり、合理的な薬物投与設計を行うことも可能になる。 まず、健常人から得た新鮮血液を用いて遠心分離によりPRPを調製し、ADP添加により血小板を活性化した直後に還元アルキル化処理し、トリプシンで蛋白質を断片化し、血小板凝集カスケードの最下流であるTalinがCalpainによりTalin-HeadとTalin-Robに切断される過程を指標とし、これらに特異的なアミノ酸配列を検出できるLC-TOF MS条件を検討した。特異的なアミノ酸配列としてSTVLQQQYNRに相当するMSシグナルを選択できた。そこで、合成ペプチドを用いてMSによる測定の条件を検討した。未だ若干の夾雑物の影響を受けるものの、必要な濃度範囲で直線性が得られ、測定可能であることがわかった。また、その測定結果はウエスタンブロッティングによる測定と矛盾しなかった。現在、夾雑物を取り除き精度よく測定できる方法に改良中である。
また、今後薬物による影響を動物実験で検討するため、ラットにおけるtalin特異的配列を同定し、その測定条件の検討も進めている。ヒトと同様の手法で測定可能となる見込みであり、特に問題は生じていない。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

まず、標的タンパクであるヒトTalinをトリプシン処理して得られるペプチド断片のうち、Talinに特有の配列でMS検出可能なペプチドを探索し、STVLQQQYNR、および他の３つのペプチド配列を決定した。STVLQQQYNRのMSによる測定条件を検討し、定量的に測定できる条件を確立できたが、生体試料を用いると夾雑物質による影響を受けるため、さらに測定法を改良中である。測定結果はウエスタンブロッティングによる結果と矛盾せず、濃厚血小板液をADP刺激した後の試料の測定も可能な見込みとなった。そこで、動物実験を想定してラットTalinについても同様の検討を行っている。

Strategy for Future Research Activity

最終目標はヒト試料を用い、実際に臨床で行われている血小板凝集能測定値を反映し、かつ保存検体で測定できる指標を見出し、血小板凝集阻害薬の効果を評価することである。しかしながら、ヒトで薬効測定を行うことは制約が大きいため、当面は動物実験により測定の妥当性を検討することとした。種を変更したため測定対象ペプチドの選定や測定条件の確立を再度行う必要があるが、技術的には確立できているため問題はない。動物実験に変更することにより、薬物による影響などの検討を進めやすくなることが期待される。

Causes of Carryover

実際の納品額が見積額と食い違ったため。次年度の消耗品費として使用する。