2022 Fiscal Year Research-status Report
Determination of cell type(s) in which DLG1 exerts its role during the cardiovascular formation.
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21K06728
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
向後 晶子 群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (20340242)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 発生 / 心臓 / DLG1 / ノックアウトマウス / 心奇形 / 流出路 / 細胞系譜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内極性因子として知られるDLG1蛋白質の遺伝子欠損マウスは、高率に先天性心奇形を発症する。本研究は、心臓、とくに心臓流出路の発生におけるDLG1の機能を、細胞系譜特異的Dlg1遺伝子ノックアウトマウスを用いて解明することを目的としている。
心臓流出路は、神経堤（NC)に由来する細胞と、二次心臓領域（SHF)に由来する細胞によって構成され、発生過程では両系譜細胞間の相互作用が必要である。一方、遺伝子レベルでは、どちらかの系譜での発現だけが流出路発生に必要な遺伝子の例も報告されている。本研究では、それぞれの細胞系譜で特異的にDlg1遺伝子を欠損するマウスを作製し、２つの細胞系譜におけるDlg1欠損が、心奇形発症にそれぞれどの程度寄与するのかを明らかにし、その結果を基に、各細胞系譜のDlg1機能や、各細胞系譜の発生の相関関係について解析する計画である。
本年度（2022年度）は、Mef2c-AHF-Creトランスジーンを用いてSHF特異的Dlg1欠損マウス（Mef2cCre:Dlg1 cKO）およびSHF蛍光標識正常マウス（Mef2cCre:tdTomatoマウス）、Wnt1-Creトランスジーンを用いてNC特異的Dlg1欠損マウス（Wnt1Cre:Dlg1 cKO）およびNC蛍光標識正常マウス（Wnt1Cre:tdTomatoマウス）のサンプル採取と解析を開始した。予備的な観察では、Mef2cCre:Dlg1 cKOマウスは生後も生存可能であり、Dlg1 KOマウスにみられる周生期全例での致死性は、 Wnt1Cre:Dlg1 cKOマウスのみで観察された。またいずれのcKOマウスにおいても、心奇形発症率はDlg1 KOマウスよりも低くまた軽微な傾向が見られる。今後各マウスでのDLG1発現量の検証なども加え、各系譜でのDLG1機能をさらに追究していきたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では、走査型電子顕微鏡による形態解析を研究の柱の一つに据えていたが、機関の機器故障等で使用が叶わないので、現状では、系譜特異的に蛍光蛋白質を発現させて各系譜細胞を可視化し、DLG1存在/非存在下でその分布・形態・挙動を光学顕微鏡で解析するという戦略に変更している。この変更に伴い、超微細構造の解析はできないが、系譜細胞を特定した上での形態解析が可能という点で、元の計画とは異なるものの同等に価値のある結果が期待できるので、これについてはおおむね順調と考えている。
また、Mef2cDreもしくはWnt1Dreマウスを導入し、cKOしていない方の系譜をR26-TLRマウスで標識することは、各系譜のDLG1機能および系譜間相互作用を明らかにする一手段として非常に有効だが、これも予算上導入が難しいため、こちらに関しては当初の計画からは後退している。
他の試料準備や解析についてはおおむね予定通りに進捗している。
以上の状況を踏まえ、全体的にはやや遅れていると評価している。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度末までに、細胞系譜におけるDLG1機能の解析に必要な各種変異マウス輩出の為の交配体制が整ったので、引き続き変異マウス胎仔の採取を続け、表現型解析の第一段階として、十分なサンプル数について心発生の形態を解析する。すなわち、出生直前(最終段階）での組織学的評価（組織切片の解析）と、発生各段階での形態学的評価（透明化蛍光標本の共焦点レーザー顕微鏡による３D観察）を並行して実施し、各系譜でのDlg1 ｃKOマウスの心疾患発症率とその発症過程を明らかにする。また、表現型の解析と並行して、Dlg1遺伝子発現量を検証し、目的細胞系譜におけるDlg1遺伝子発現の低下を確かめる。
次の段階として、Dlg1遺伝子欠損時の各系譜の細胞分化の異常の有無を検証する。この目的には、細胞系譜特異的なDlg1-lox遺伝子の切り出し（Dlg1欠損）と蛍光蛋白遺伝子のスイッチオンをCre系、Dre系とに分けて独立に操作できる実験系が確実であるが、予算上Dreドライバーマウスを導入できない。そこで次善の策として、全身Dlg1 欠損下で各細胞系譜特異的に蛍光を発現させて特定し、Dlg1の欠損がそれぞれの系譜細胞の形態、分布、増殖、細胞死、機能分子の発現に与える影響を解析する。また、Cre-loxPシステムで細胞系譜特異的Dlg1ノックアウトと蛍光蛋白遺伝子のスイッチオンの両方を駆動する系で同様の解析を行う。その場合は、両遺伝子の間で転座とそれによる予期せぬ遺伝子発現が生じる可能性も視野に入れて検証作業を行う。
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| Causes of Carryover |
本研究では、もともと配分された交付額が計画額より少なかったため、実験に必要な動物の維持や試薬購入費用に用いる予算がひっ迫することが当初から予想できていた。初年度の動物導入は研究実施のために欠かすことができないので計画書どおりに予算額を当てて実施したが、その分、2年目以降の予算配分を相当に低く設定せざるを得ず、研究に最低限必要な費用を賄えていない。さらに所属機関からの研究費も足りないので、本研究に関して実際には出張費用などに相当額の私費を充当してきた。従って、ここには次年度使用額という「残額」が記載されているものの、実質的には既に相当の赤字状態であり、この残額は大学への動物飼育費用として請求された額に満たないため支払いに使えず、見かけ上残っただけである。この次年度使用額については、来年度の計画予算と併せ、各種試薬、動物飼育費用などに充当するが、昨年度までと同様、当該予算のみで本課題の遂行を賄うことは難しいと考えている。
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Research Products
(1 results)
