2021 Fiscal Year Research-status Report
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21K06733
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
大崎 雄樹 札幌医科大学, 医学部, 教授 (00378027)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 脂肪滴 / 中性脂質 / PML / 液晶化 / 核内構造体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コレステロールエステル（CE）とトリアシルグリセロール (TAG)から成る中性脂質をリン脂質一重膜が覆う構造である脂肪滴は、通常小胞体膜から形成される細胞質オルガネラであるが、我々は肝由来細胞では脂肪滴が核膜陥入構造と近接し、タンパク質修飾や遺伝子発現制御に関与するPML小体と複合体を形成して存在すること、核内脂肪滴は小胞体内腔の中性脂質顆粒であるリポプロテイン前駆体に由来し、ホスファチジルコリン（PC）合成を活性化させて小胞体ストレスを軽減する装置として働き得ることを以前に報告した。一方核内脂肪滴は非肝由来細胞でも形成されることから、細胞の種類を問わないユニバーサルな形成機序の存在が示唆されていた。
本計画において今年度はまず非肝由来細胞における新規の核内脂肪滴形成機序を探索した結果、内核膜には本来小胞体に局在する脂質合成酵素群が存在し、核内で直接、中性脂質合成と脂肪滴形成が行われることを明らかにした。さらに細胞質脂肪滴の形成に重要な小胞体膜貫通タンパク質Seipinが、ジアシルグリセロール (DAG)合成酵素であるLipin1 betaの転写を抑制することで核内脂肪滴の形成を負に制御することを見出した。これらの成果は国際学術誌および国内学会において報告した。
一方、核膜の変形を司る分子候補Tの発現量と核内脂肪滴および核膜陥入構造（NR）の形成とが逆相関することを見出した。さらに肝疾患疑い患者の肝生検試料の電顕観察により、人の肝細胞内で実際に核内脂肪滴が頻繁に形成されることが判明した。
他方核内脂肪滴の生理的意義の解明については、一部の脂肪酸結合タンパク質が核内脂肪滴に局在し、がん形成促進因子の転写を制御することを見出した。また一部のDNA損傷修復系分子が核内脂肪滴に局在することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究内容の各項目に沿って記述する。
A: 核内脂肪滴の新規形成機序の解明。肝由来細胞での核内脂肪滴の原料となるリポプロテイン前駆体を持たないU2OS細胞（骨肉腫由来）において、本来は小胞体膜に局在する中性脂質合成経路酵素群（GPAT family, AGPAT family, Lipin family, DGAT1/2, アシル基転移酵素ACSL familyなど）が、内核膜にも局在することを、split-GFP技術を用いたBiFC (蛍光タンパク質再構成法)、蛍光免疫染色、免疫電顕などにより明らかにした。ライブイメージングでは内核膜から脂肪滴が直接形成されることが示された。TAGの前段階であるDAGをホスファチジン酸(PA)から合成する酵素Lipin familyのうち、Lipin-1 betaが核内脂肪滴形成に重要であった。PAは核内脂肪滴表面に一過性に集積離散を繰り返すことが判明した。小胞体膜貫通分子であり、小胞体での細胞質脂肪滴合成の足場機能をもつSeipinを発現抑制すると、Lipin1の転写亢進により核内脂肪滴が増加した。以上の新規知見は国際学術誌に発表した。
B: 脂肪滴-核内構造体の間の相互作用。DNA鎖間架橋の修復に関与するFANCタンパク質群の一部が、核内脂肪滴に局在していた。また細胞全体脂肪滴の形成阻害によりDNA損傷が亢進し、逆にSeipin発現抑制により核内脂肪滴形成を増加させるとDNA損傷が抑制された。
C: 脂肪滴脂質の液-液晶相転移と脂肪滴局在分子機能との連関。脂肪細胞分化モデル3T3-L1細胞において、分化誘導中にコレステロールを与えてCE形成を促進させると、脂肪滴の液晶化を示す偏光像が検出された。一方マクロファージ分化モデルTHP-1細胞はコレステロール投与法では偏光を持つ脂肪滴が得られず、貪食作用など別の刺激との併用が必要な可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
核内脂肪滴の形成機序解明については、肝疾患疑い患者の肝生検試料の電子顕微鏡観察により、実際の人肝細胞で核内脂肪滴が豊富に形成されている事例が多く見つかりつつある。今後は症例を蓄積し、患者の病歴、治療歴と血液生化学、肝組織超微形態観察を組み合わせ、これまで鑑別のつかなかった肝障害の新たな病理診断基準の設立をめざすとともに、核内脂肪滴形成を促進する薬理機序を推定し、細胞および動物モデルを用いて分子機序解明を行う。
核内脂肪滴形成に関与する脂質合成酵素が細胞周期間期において核膜孔を介して内核膜に移行する可能性を、外来性タグを増やして酵素の分子量を増やす、あるいは核膜孔移行阻害により検討する。
核内脂肪滴と他の核内構造体との相互作用については、核内脂肪滴に局在する分子の網羅的解析が当初予定していた脂肪滴特異的結合プローブによる脂肪滴近接分子精製法が難航しており、新たなプローブを用いた沈降法を予備実験中であり、次年度も引き続き進行し、得られた候補分子の局在、機能を一過性発現系および発現抑制により確かめる。一方核内脂肪滴とDNA損傷修復系との関連については、核内脂肪滴場で修復因子が活性化をうけるのか、それとも分解されるのかを調べる。また長期間飢餓状態では核内脂肪滴にクロマチン結合が増加する予備的知見を得ており、核内脂肪滴が飢餓応答因子の転写調節に関与する可能性を検討する。
他方、培養細胞および動脈硬化モデルマウスの病変部位脂肪組織、マクロファージを用い、脂肪滴脂質変化と液晶化に依存した脂肪滴表面タンパク質の組成変化を検索する。また、脂肪滴のCE/TAG比率の変化に依存して異なる蛍光減衰を示す新たな蛍光プローブを作成中であり、その特性をさらに検討する。
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