2022 Fiscal Year Research-status Report
膜融合関連分子による細胞の極性形成および細胞増殖の調節機構の解明
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21K06734
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
國井 政孝 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (80614768)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 細胞極性 / SNARE蛋白質 / SNAP23 / Syntaxin3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細胞内において膜蛋白質や分泌蛋白質を運ぶ輸送小胞と細胞膜との融合に働くSNARE蛋白質であるSNAP23とSyntaxin3の、上皮細胞の極性形成や細胞増殖における機能を解明することを目的とし、これらの分子の遺伝子欠損マウス（KOマウス）や遺伝子ノックダウン細胞などを用いて解析を行っている。
これまでに、神経組織特異的SNAP23 KOマウスの解析から、SNAP23が発生中の大脳皮質脳室帯に存在する神経前駆細胞において細胞間接着に関わる分子であるN-cadherinの頂端膜への局在化に重要であり、細胞間接着複合体の形成を通して神経前駆細胞の極性形成に寄与していることを明らかにした。さらに、N-cadherinの細胞膜局在化においてSNAP23と共同で働くSNARE蛋白質としてVAMP8とSyntaxin1Bを同定し、これらの研究成果を発表した。
令和4年度は主にSyntaxin3の小腸上皮特異的KOマウスについて解析を行った。Syntaxin3は上皮細胞の頂端面に局在するt-SNARE分子であり、頂端膜方向への極性輸送に重要と考えられている。小腸上皮特異的Syntaxin3 KOマウスを作製した結果、小腸上皮細胞において本来は頂端面に局在する蛋白質分子が細胞内へ異所的に局在する様子が観察された。このことから、Syntaxin3が頂端面への極性輸送に重要であり、極性輸送を介して上皮細胞の極性形成に関わっていることが示唆された。また、上皮細胞の細胞増殖の亢進が認められたことから、細胞極性の異常が増殖亢進へ関わっている可能性が示唆された。この分子メカニズムを解明するため、RNAseqやプロテオミクス解析を行い、細胞増殖に関わるいくつかの因子を同定した。現在これらの因子の分泌メカニズムの解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では上皮細胞の極性形成や細胞増殖におけるSNARE蛋白質の機能を解明するため、組織特異的KOマウスや培養細胞、小腸オルガノイドを用いて解析している。神経特異的SNAP23 KOマウスの解析は計画通りに進展し、SNAP23がVAMP8, Syntaxin1Bと共にN-cadherinの細胞膜局在化を促進し、細胞間接着複合体の形成を通して神経前駆細胞の極性形成に関与していることを明らかにした。この神経前駆細胞の正常な極性形成がその後の神経細胞への分化や層形成、細胞の生存に重要であり、正常な脳の発生へとつながることを明らかにした。
令和4年度は主に小腸特異的Syntaxin3 KOマウスの解析を行った。KOマウスの小腸上皮細胞では頂端面に局在するアミノペプチダーゼなどの蛋白質が細胞内に溜まる様子が見られ、小腸上皮細胞の極性形成異常が示唆された。また、上皮細胞の増殖亢進が観察されたことから、極性形成の異常が細胞増殖の異常へとつながっている可能性が考えられた。増殖亢進の原因を特定するため、RNAseqやproteomicsによる解析を行い、増殖亢進の原因と考えられる分子の候補を同定した。KOマウスの腸や腸管上皮由来の細胞株を用いた解析により、Syntaxin3の欠損によっていくつかの細胞増殖因子の分泌量に差が認められた。これらの結果は当初の研究予定に照らし、概ね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き小腸特異的Syntaxin3 KOマウスの組織学的解析や、腸管上皮由来の細胞株および小腸オルガノイド培養系を使用した細胞増殖亢進の分子メカニズムの解明を進める。次年度は研究計画の最終年度となるため、結果を論文としてまとめ、成果を報告する予定である。
KOマウスの小腸上皮細胞では頂端面に局在する膜蛋白質の細胞内への蓄積が認められたことから、ヒトの微絨毛萎縮症と関連がある可能性があるため、頂端面の微絨毛の形態や微絨毛封入体を免疫染色や電子顕微鏡を用いて解析していく。
また、いくつかの細胞増殖因子の候補を同定し、KOマウスの小腸上皮細胞や腸管上皮由来の細胞株において分泌量の変化が認められたことから、これらの増殖因子の細胞内での輸送のイメージングや小腸オルガノイドや上皮細胞株の3次元培養を用いた解析によって増殖因子の細胞内輸送および分泌の分子メカニズムを解明したいと考えている。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルスの影響でオンライン開催となっていた国内外の学会が今年度から現地開催へと戻ってきたが、参加を見合わせることなどもあり旅費の使用額が予定額よりも少額となった。
また、消耗品の購入や動物の維持管理費用なども想定額より少額となり、前年度からの繰り越しもあったため残額の次年度への繰り越しが生じた。
令和５年度は学会参加や研究活動において昨年度よりも使用額が増加することが予想される。特に小腸オルガノイドの培養に必要な試薬や増殖因子の定量に用いるELISAキットなどはやや高額であり、また、論文の投稿に係る費用も想定されるため、当初の予定通りに使用できるものと考える。
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