2021 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of the molecular mechanism for myoblast fusion using fluorescence polarization imaging
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21K06750
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
佐藤 啓介 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60644044)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺田 純雄 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00262022)
川岸 将彦 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606)
齊藤 健太 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (60374659)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | アクチン / 蛍光偏光 / 筋芽細胞 / 細胞融合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、F-actinを標識する蛍光偏光プローブを安定発現する筋芽細胞株C2C12細胞のセルラインの作製と、それを用いた蛍光偏光顕微鏡タイムラプスイメージング条件の検討を行った。
セルライン作製については、緑色蛍光・赤色蛍光のそれぞれのプローブについて、トランスポゾンを用いたゲノムインテグレーション法を用いて、ポリクローナルな安定発現細胞の集団を得た。これをモノクローナル化して、分化融合能を持つ安定発現セルラインを複数得た。これらについて、融合能を評価するためのFusion indexを算出し、親株のC2C12細胞と比べて同等以上の分化・融合能をもつ安定発現セルラインを緑色蛍光・赤色蛍光のそれぞれについて選別した。
蛍光偏光顕微鏡タイムラプスイメージングについては、緑色蛍光偏光プローブと、赤色蛍光偏光プローブを発現する細胞どうしが融合する過程を観察することを試みた。インターバルを長くとった、長時間のタイムラプスにおいては融合する過程を観察することができた。次に、融合時のアクチン動態を詳細に観察するために、インターバルを短くしたタイムラプスをおこなったが、融合のイベントの頻度が非常に低いため、観察時間が長くなってしまい、光毒性による細胞の生育の低下や蛍光褪色がおきてしまった。現在、融合の頻度を上げるための工夫と、融合間近な細胞を判別する方法の検討を進めている。また、細胞融合を誘導するためには細胞密度を非常に高くする必要があるが、細胞密度が高いと細胞が重なり合ってしまい、細かいアクチン構造を顕微鏡観察するのが難しいことも判明した。これを解決するための工夫についても条件検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
COVID-19の影響により、在宅勤務をする期間が多くあり、実験可能時間が減少してしまったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
少し遅れはあるものの、現在のところ計画変更の必要性は無いので、従前の計画に従って進める。まずは、研究概要に書いた通り、融合の頻度を上げるための工夫と、融合間近な細胞を判別する方法の検討、および、細胞密度が高いことに起因する顕微鏡観察の困難な状況を解決する方法の検討を行う。具体的には、過去に筋芽細胞の細胞融合を促進することが報告されている薬剤が複数存在するため、タイムラプスイメージングに十分な程度に細胞融合の頻度が上昇するかどうか検討する。融合間近な細胞を判別する方法として、過去の文献を参考にして、筋芽細胞の融合に関連することが報告されている細胞の形態変化、細胞内小器官の構造や形態変化、細胞内シグナリング分子の濃度変化に着目した検討を行う予定である。これには、それぞれの変化を検出するためのプローブの作製または購入、また観察条件の検討が必要となる。
細胞密度の問題については、まずは、細胞集団に、蛍光偏光プローブを発現しないC2C12細胞を混ぜることにより、プローブを発現する細胞の割合を低くすることを検討する。また、TIRF（全反射蛍光顕微鏡）観察、共焦点レーザー顕微鏡観察を組み合わせることにより、細胞の重なりがあっても細かい構造が観察可能になることが期待される。しかし、これらの手法はレーザーを用いない場合と比べてより強い、または頻度の高い光照射による励起を必要とするため、光毒性・蛍光褪色の問題が強くなる可能性がある。条件検討により、TIRF観察、共焦点レーザー顕微鏡観察による構造検出感度の向上と、光毒性・蛍光褪色のバランスが取れた観察条件の確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
COVID-19の影響により、計画の進行に遅れが生じ、次年度に回した計画が生じたこと、また、宿泊を予定していた学会参加がオンラインになり、交通費・宿泊費が生じなかったため。
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| Remarks |
A new polarized fluorescent probe for revealing architectural dynamics of living cells by Sumio Terada, Keisuke Sato & Ayana Sugizaki
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