新規アルツハイマー病治療薬創出に向けたNRBP1-ユビキチンリガーゼ阻害剤の探索

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06769
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 安川 孝史 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 講師 (60291936)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ユビキチンリガーゼ / アルツハイマー病 / BRI2 / BRI3 / NRBP1

Outline of Annual Research Achievements

NRBP1-BRI2間の結合を阻害する化合物のスクリーニングを、理研NPDepo（天然物化合物）ならびに東大コア（低分子化合物）のライブラリー（約3万化合物）を用いて実施した（下記の一次/二次から高次評価）。
(1) 一次評価/二次評価（理化学研究所の創薬・医療技術基盤プログラム支援のもと実施）: BRI2とNRBP1に二分割した分泌型ガウシアルシフェラーゼ（Gluc）のN末側（Gn）、C末側（Gc）を各々連結させたGn-BRI2とGc-NRBP1を用いた2分子発光補完法によるハイスループットスクリーニングを行った。一次評価では、化合物濃度5 μMにおいてNRBP1-BRI2間の結合阻害率50%以上かつ細胞増殖阻害率50%以下のものを選抜して439個の化合物が得られた。二次評価では、結合阻害の濃度依存性試験と偽陽性を排除するための全長Glucを用いたカウンター試験を行い88個の化合物が得られた。(2) 三次評価：BRI2とTR-TUBE（トリプシン抵抗性ユビキチン鎖結合タンパク質）を発現させたNRBP1安定発現293T細胞に化合物を添加し、NRBP1-ユビキチンリガーゼによるBRI2のユビキチン化を阻害するものを選抜し12個の化合物が得られた。(3) 高次評価：三次ヒット化合物を、① 神経系培養細胞に添加して、細胞内のBRI2/BRI3タンパク質量が増加し、かつ培養上清中のβアミロイド（Aβ）40/42の濃度が低下するもの、② Gn-Aβ42とGc-Aβ42の安定共発現293T細胞に添加して、培養上清中のAβの凝集を抑制するものを選抜し、最終的に天然物由来の2個のヒット化合物A、B（未発表のため仮称）が得られた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コロナ禍の影響で化合物の入手等に時間を要した。 また、天然物由来の化合物は分子構造が複雑なため合成が難しく、類縁体の幅広い合成展開が難しい状況である。現在、得られたヒット化合物の類縁体の合成を可能な範囲で進めている。

Strategy for Future Research Activity

タンパク質間相互作用の阻害を予測して分子設計・合成され、且つ合成展開が可能なAMED（国立研究開発法人日本医療研究開発機構）の中分子化合物ライブラリーのスクリーニングを実施する。さらに、特殊環状ペプチドライブラリーのスクリーニングも行う予定である。

Causes of Carryover

コロナ禍の影響で、化合物の入手等に時間を要し研究に遅延が生じたため。
生じた次年度使用額は、翌年度分と合わせて引き続き化合物のスクリーニングに必要な試薬・プラスティック器具等の購入に充てる。

Research Products

• [Presentation] NRBP1-ユビキチンリガーゼは生理的抗アルツハイマー病因子であるBRI2/BRI3の分解を制御する (2021)
  • Author(s): 安川 孝史, 筒井 文, 佐藤 チエリ, 佐藤 滋生, Anita Saraf, Michael P Washburn, Laurence Florens, 寺田 透, 清水 謙多郎, Ronald C Conaway, Joan W Conaway, 麻生 悌二郎
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会