2021 Fiscal Year Research-status Report
Analyses of the gating mechanisms based on the Non-domain swapped architecture of the hERG channel
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21K06771
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
粂 慎一郎 大分大学, 医学部, 助教 (90794579)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / hERGチャネル / 構造機能連関 / 分子生物学 / 電気生理学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電位作動性カリウムチャネルファミリーに属するhERGチャネルは、N末端およびC末端細胞内領域に存在する各固有ドメインや、膜貫通領域に見られるNon-domain swapped構造に基づき、細胞膜直下に4つの細胞内ドメイン（N末端側からN-tailドメイン、S2-S3リンカードメイン、S4-S5リンカードメイン、Cリンカードメイン）が集中する局所的な領域が存在する。申請者はこれまでに、これら4つの細胞内ドメインが互いに相互作用し得る位置関係にあり、各ドメインへの変異の導入がその特徴的な遅い脱活性化を著しく加速させることを見出した。しかし、これらのドメイン間相互作用の実態と、それによるチャネルの構造機能連関の詳細は、未だ不明な点が多い。
本研究では、これら4つの細胞内ドメインに焦点を当て、①これらのドメイン間で形成される相互作用の有無、また、チャネルの開・閉状態に依存した各ドメイン間相互作用の局所的な構造変化と、それに伴う主要なアミノ酸の位置関係の解明を目指す。さらに、②ゲーティングに伴うチャネル分子全体の構造変化における各ドメイン間相互作用の役割と、それに基づく遅い脱活性化の制御機構との関係性を解明すべく、FRETを用いた実験・解析を計画している。
本年度は主に、上述の①と②の実験・解析のための準備を実施した。①に関しては、今後の実験・解析での使用を予定しているhERGチャネルの変異体の作製等を行った。また、使用する予定の実験機器に故障が生じたため、その修理や調整を行った。②に関しては、現在本学に設置されているカルシウムイメージング用の顕微鏡セットをFRET解析に流用する計画のため、不足していた蛍光フィルター等の顕微鏡パーツを購入し、設置および調整を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、hERGチャネルの遅い脱活性化に関する構造機能連関の解明を目指し、Non-domain swapped構造に伴い局所的に存在する特徴的な4つの細胞内ドメインに焦点を当て、「研究実績の概要」で上述した①および②の実験・解析を計画している。
①に関しては、4つの細胞内ドメインの任意のアミノ酸をシステインに置換し、それらを組み合わせたシステイン二重変異体を作製した後、膜電位固定下で酸化剤添加を添加した際のジスルフィド結合形成の過程を電流の変化としてパッチクランプ法により測定・解析する。本年度では、この準備として使用する変異体の作製等を行い、いくつかの変異体に関しての解析を開始した。しかし、年度途中でパッチクランプ法に使用している顕微鏡セットに故障が生じ、新しい実験機器の購入やその後のセットアップなどを行っていたため、それ以上の解析は行えていない。
②に関しては、膜貫通領域と細胞内ドメインそれぞれに蛍光タンパク質（CFPとYFP）を融合させた変異体を作製し、分子構造の変化をCFP-YFP間のFRET効率の変化として測定・解析する。申請時の研究実施計画では次年度以降の実施を計画していたが、先に顕微鏡の準備のみ行うことにし、不足していた蛍光フィルター等の顕微鏡パーツを購入した後、設置および調整までを完了した。
以上のように、特に①について、実験機器の故障による影響のため申請時の実験実施計画から遅れが生じている。また、新型コロナウイルス感染症への対策としての対面授業の中止に伴う授業動画の作製など、当年度の数ヶ月間は持続的に実験を行えない状態が続いた。以上のような理由から、本研究における現在までの進捗状況は、申請時の研究実施計画からやや遅れていると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は今後とも、hERGチャネル独自のNon-domain swapped構造と、それに伴う4つの細胞内ドメインの関係性に焦点を当て、このチャネルの遅い脱活性化に関する構造機能連関の解明を目指す。
当年度の研究では、「研究実績の概要」や「現在までの進捗状況」にて上述したように、①の実験・解析において遅れが生じている。しかし、故障していた実験機器の修理および調整は本年度内に完了しているため、次年度ではまず①の実験・解析の完了を目標に、4つの細胞内ドメイン間で形成される相互作用の有無、また、チャネルの開・閉状態に依存した各ドメイン間相互作用の局所的な構造変化と、それに伴う主要なアミノ酸の位置関係の解明を目指す。
②の実験・解析についても、蛍光タンパク質を融合した変異体の作製や予備実験等の準備を開始し、ゲーティングに伴うチャネル分子全体の構造変化における各ドメイン間相互作用の役割と、それに基づく遅い脱活性化の制御機構との関係性の解明を目指す。
また、得られた結果をまとめ、論文としての発表、または学術大会での発表を考えている。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた主な理由としては、上述した「現在までの進捗状況」に記載したように、本研究の一部の進捗状況が申請時の研究実施計画から遅れていることが挙げられる。当年度では、「研究実績の概要」で上述した①の実験・解析が途中の段階であり、そこで使用する予定であった物品・試薬等の購入に至らなかった。また、学術大会へ参加するための旅費として考えていた額については、コロナ禍の影響による学術大会のオンライン開催への移行に伴い、本年度中に使用することができなかった。以上のような理由により、次年度使用額が生じる結果となった。
ここで生じた次年度使用額に関しては、研究実施計画に基づき、今後の実験・解析のために使用する予定である。具体的には、当年度で終了できなかった①の解析を行う上で必要になる試薬や物品等の購入費、コロナ禍の収束により学術大会の会場での開催が可能になった際の旅費、および、論文として発表する場合はその費用として使用する予定である。
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Research Products
(4 results)
