2022 Fiscal Year Research-status Report
糖尿病網膜症の病態形成におけるYAP/HIF-1α複合体の役割
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21K06787
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
柏原 俊英 北里大学, 薬学部, 講師 (20552334)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 糖尿病網膜症 / ミュラー細胞 / YAP/HIPPOシグナリング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
YAPは、細胞の生存、エネルギー代謝などを制御する重要な転写共役因子である。研究代表者は、最近、YAPの活性化がHIF-1αを介してGLUT1の発現を誘導することを見出した。そこで本研究では、糖尿病モデルラットの網膜においてYAPが活性化しているか否か、活性化したYAPがHIF-1αを介してGLUT1の発現を増加しているか否かについて明らかにすることを目的とした。本年度では、ストレプトゾトシン（STZ）投与誘発性1型糖尿病モデルラットにおいてYAPが活性化しているか否か明らかにするため、活性化型YAPの抗体を用いてWestern blot法で発現量を検討した。Vehicle投与群に比べSTZ投与群の活性化型YAPは、投与2ヶ月後において有意に増加した。網膜は、神経細胞、グリア細胞など複数の細胞で構成される器官である。そこで免疫組織染色法で活性化型YAPの発現様式を調べた。Vehicle投与群及びSTZ投与群のいずれにおいても活性化型YAPは、ミュラー細胞に多く存在していたが、STZ投与群の方がVehicle投与群に比べ活性化型YAPのシグナルは強かった。糖尿病では高反応性糖代謝物のメチルグリオキサール（MGO）の血中及び細胞内濃度が増加し病態形成に働くことが示唆されている。そこで、YAPの活性化へのMGOの関与を検討するため、MGOの硝子体内投与を行い、YAPの活性化を検討した。その結果、MGOラットのミュラー細胞において顕著な活性化型YAPの発現増加が認められた。ミュラー細胞株rMC-1を用いてMGOが直接ミュラー細胞のYAPを活性化するか評価したところ、MGO刺激はrMC-1のYAPの発現レベル及び活性化には影響しなかった。これらの結果より、高血糖や網膜におけるMGOの増加は、網膜傷害を引き起こし、ミュラー細胞のYAPを活性化する可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究代表者は、前年度にSTZラット網膜のミュラー細胞においてYAPの発現量が増加することを見出した。しかしながら、YAPは、非リン酸化型の活性化型とリン酸化型の不活性化型の状態が存在するため、YAPシグナルの亢進を評価するためには活性化型YAPの発現変化を知る必要がある。そこで、最近知られるようになった活性化型YAPの抗体を用いて、YAPの活性化状態をWestern blot法で検討した。Vehicle投与群に比べSTZ投与群の活性化型YAPは、投与1ヶ月後では増加傾向にあったが、2ヶ月後において有意な増加が認められた。免疫組織染色法で活性化型YAPの発現様式を調べた結果、Vehicle投与群及びSTZ投与群のいずれにおいても活性化型YAPは、ミュラー細胞に多く存在していた。しかしながら、STZ投与群の方がVehicle投与群に比べ活性化型YAPの蛍光シグナルは顕著に強かった。これより、高血糖刺激はミュラー細胞のYAPを活性化することが示唆された。糖尿病では高反応性糖代謝物のメチルグリオキサール（MGO）の血中及び細胞内濃度が増加し病態形成に働くことが示唆されている。そこで、YAPの活性化へのMGOの関与を検討した。MGO硝子体内投与は、ミュラー細胞において活性化YAPの発現量を顕著に増加した。これより、高血糖によるYAPの活性化にMGOが関与する可能性が考えられた。そこで、MGOが直接ミュラー細胞のYAPを活性化しているのか明らかにするために、ミュラー細胞株rMC-1を用いてYAPの発現変化を評価した。rMC-1におけるMGO刺激は、YAPの発現量と活性に影響を与えなかった。これらの結果より、糖尿病時の網膜では、高血糖やMGOの増加により網膜傷害が引き起こされ、ミュラー細胞のYAPが活性化されるのではないかと考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、STZ誘発性1型糖尿病モデルラット及びMGO硝子体内投与モデルにおいて、YAPが活性化するメカニズムを検討する。また、YAPの標的遺伝子の発現量の変化を調べる。具体的には、網膜におけるこれらの因子の発現レベルをmRNA又はタンパク質レベルで解析し、免疫組織染色法にて変化のある細胞を同定する。これにより、YAP- HIF-1αの標的遺伝子であるGLUT1の発現変化を調べる。また、YAPがGLUT1以外の他の因子に影響している可能性を検討する。詳細なメカニズムについてはラットミュラーグリア細胞株rMC-1を用いたin vitroの実験で明らかにする。糖尿病モデルラット網膜におけるYAPの機能的役割については、網膜のYAPを阻害するin vivo実験にて明らかにする。
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