2022 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of tumor growth mediated by pyruvate dehydrogenase PDH
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21K06815
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
中山 恒 旭川医科大学, 医学部, 教授 (10451923)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ピルビン酸脱水素酵素PDH / 代謝 / 細胞増殖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題では、ピルビン酸脱水素酵素PDHのノックダウンにより腫瘍形成能が低下する分子機序を、代謝調節と遺伝子発現の両側面から明らかにすることをめざして、研究を進めた。前年度、樹立に成功したPDHE1a, PDHE1bのノックアウト細胞を、異なる乳がん細胞株(MCF7)および大腸がん細胞株(HCT116)についても作製し、それらの表現型を確認したところ、いずれも細胞増殖が抑制されていることが明らかになった。次に、これらの細胞に、ドキシサイクリン添加によりPDHの発現が誘導されるベクターを導入し、レスキュー実験を行った。PDHE1a, PDHE1bのそれぞれのレスキュー実験に関して、異なるドキシサイクリンの濃度条件を検討して、毒性を示さず、内在性遺伝子と同等の発現量が得られる濃度を決定した。この濃度でドキシサイクリンを添加したところ、各PDHの発現がレスキューされると共に、PDHを構成する他のサブユニットの発現も正常化することがウェスタンブロットにより明らかになった。さらに、同じドキシサイクリン誘導システムを用いて、ドキシサイクリン添加によりGFPの発現が誘導される乳がん細胞株を樹立した。この細胞をヌードマウスに移植し、ドキシサイクリン添加の有り無しで飼育したところ、添加有りのマウスに形成された腫瘍においてGFPが発現誘導されることを確認した。これらの一連の実験により、レスキュー実験の基礎となるシステムが確立された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ノックアウト細胞の樹立、レスキューシステムの確立、マウスへの移植実験を完了したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
PDHを誘導性に発現させることによりノックアウトをレスキューできる乳がん細胞をマウスに移植して、異なるタイミングでドキシサイクリンを投与した時に、どのタイミングの投与であれば、レスキューが可能であるのかを明らかにする。さらに、核PDHの解析を、PDH強制発現細胞のmRNA-seq解析を実施して、PDH KD細胞の遺伝子発現様式と比較することにより進め、核PDHの標的遺伝子を明らかにする。さらに、この時の遺伝子発現にはヒストンのアセチル化が必要であるのかを、ヒストンアセチル化抗体を用いたChIP解析により明らかにしたい。
これらの知見をまとめて、論文を発表する。
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| Causes of Carryover |
次世代シークエンス解析を次年度に行うこととしたため。
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