2022 Fiscal Year Research-status Report
抗酸化リン脂質生合成における新規基盤と破綻による神経変性の解明
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21K06824
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
堀端 康博 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (80392116)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | リン脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脳神経では多量の酸素が消費されているが、同時に多量の活性酸素も発生している。プラズマローゲンは脳神経に豊富に含まれる抗酸化リン脂質で、活性酸素などによる酸化ストレスから神経細胞を保護するのに重要な役割を持つ。これまでプラズマローゲンの生合成はペルオキシソームで始まり、小胞体で完成するとされてきた。しかし、研究代表者はゴルジ体に局在する酵素EPT1がプラズマローゲンの最終生合成に大きく寄与していることを見出した。つまり、プラズマローゲンが合成される過程で、脂質中間体の一部は小胞体からゴルジ体へ輸送される必要があることが示唆された。しかし、この輸送機構に関わるタンパク質はこれまで同定されていない。昨年度、上記の輸送に関わるタンパク質としてAを見出し、試験管内の測定系で脂質中間体を輸送することを見出した。本年度ではAを欠失した細胞を樹立し、プラズマローゲンの合成について解析した。
CRISPR/Cas9によるゲノム編集によりAを欠失したHEK293細胞を樹立した。この細胞のリン脂質をLC-MS/MSで解析したが、プラズマローゲンの量に変化はなかった。次にAとEPT1の両方を欠失した細胞（DKO細胞）を樹立し、プラズマローゲンを調べた。これまでの我々の結果を支持するように、この細胞ではプラズマローゲンが著減していた。また以前我々はEPT1欠失細胞ではプラズマニルコリンが蓄積することを報告していた。今回、DKO細胞ではEPT1が単独で欠失した細胞と比べてより多くのプラズマニルコリンが蓄積していた。これはAの欠失に脂質中間体が小胞体に蓄積し、小胞体に局在するCPT1やCEPT1によってプラズマニルコリンに変換されていることを示唆する。またDKO細胞にAを再発現するとプラズマニルコリンの蓄積が減少した。以上の結果から、Aはゴルジ体ー小胞体間で脂質中間体を輸送していることが強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記の様に、令和４年度では候補Aを欠失した細胞を用い、脂質中間体の輸送に関わることを示すデータを得ることができた。以上から本研究計画は概ね順調に進んでいると思われる。現在、小胞体のCEPT1とAの両方を欠失した細胞を樹立し、プラズマローゲンが低下するかの実験を計画している。また、Aのノックアウトマウスについてはすでに先行研究があり、今後購入あるいは分譲で入手して解析するかどうかについては現在検討中である。
ところで、本研究の課題であるプラズマローゲン生合成に関わる輸送機構を十分に理解するためには、輸送先のプラズマローゲン最終合成酵素（CEPT1、EPT1およびCPT1）についても理解を深めておく必要がある。しかし、これらの酵素の基礎的知見は少なく、特に構造学的解析はほとんど行われていない。今年度、上記酵素の立体構造解析についてミシガン大学から共同研究の依頼があった。この解析によって得られる成果は本研究課題を遂行するためにも重要であると判断し、共同研究に加担した。立体構造については大方解析が終了した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和５年度においては小胞体のCEPT1とAの両方を欠失した細胞を樹立し、プラズマローゲンが低下するか否かを検証する。この検証が終わり次第、ここまでの研究成果をまとめ、学術論文に投稿する予定である。それと同時に、研究計画当初に候補として選定していたA以外についてもリポソーム輸送活性等を行い、新たな輸送タンパク質の同定を目指したい。また今後Aについては神経細胞などを用いて機能解析し、例えばノックダウンなどで神経細胞死が誘導されるか等を明らかにしたい。
また前述のように、Aによって脂質中間体は最終酵素であるCPT1やEPT1の元に運ばれ、プラズマローゲンの合成に利用される。このように、Aによる輸送機構と最終合成酵素はリンクしている。従って、最終合成酵素の詳細を明らかにすることは本研究に有意である。前述のように令和4年度はミシガン大学からこれらの酵素を対象とした立体構造解析について共同研究の依頼があった。現在、クライオ電子顕微鏡を用いた解析により、CPT1の立体構造についてはほぼ全容が明らかになった。その結果、活性部位や基質特異性を決定すると推定されるアミノ酸が複数見つかった。これらのアミノ酸を変異すると酵素の諸性質がどのように変化するかについて今後解析してゆく予定である。以上の解析によって小胞体やゴルジ体で行われるプラズマローゲンの輸送ならびに合成機構の全体を明らかにしたい。
また上記の共同研究が始まったことやすでに先行研究があることを考慮し、ノックアウトマウスの解析は保留している。
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| Causes of Carryover |
動物実験を保留していることや値引き交渉やキャンペーンの利用により使用額が見込額よりも下回り、次年度使用額が生じた。次年度使用額については、従来の計画通りに細胞培養用の試薬、抗体、遺伝子解析試薬等の消耗品など主に物品費として使用する。
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Research Products
(6 results)
