2021 Fiscal Year Research-status Report
Study on molecular mechanisms of fluidity of the endoplasmic reticulum
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21K06836
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
匂坂 敏朗 神戸大学, 医学研究科, 教授 (80359843)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 小胞体 / 小胞体流動 / Lunapark / ERファジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小胞体は、細胞内に網目状に張り巡らせたチューブ構造と核膜周辺にあるシート構造からなる。この二つの構造は静的なものではなく、流動的であり、チューブ構造からシート構造、その逆のシート構造からチューブ構造に速やかに変化することが知られている。その異常が神経変性疾患の発症に関わるとされているが、その因果関係は十分明らかになっていない。したがって、小胞体流動の解明は生命現象の根幹に迫るきわめて重要な課題である。本研究では、小胞体流動の分子実態は、チューブ構造、シート構造、それぞれに関わるタンパク質の小胞体膜への挿入と解離による小胞体の構造制御タンパク質のホメオスタシスと捉え、それぞれの膜挿入装置と膜解離因子の単離、同定を行う。同定したタンパク質と人工膜を用いた試験管内再構成系を用いて小胞体流動を再現すると共に、その異常である神経変性疾患の発症との機能関係を明らかにし、小胞体流動の革新的な概念を提示する。
Lunaparkは小胞体のthree-way junctionに局在する膜タンパク質であり、私どもはlunaparkのユビキチンリガーゼ活性が小胞体の形態形成に必須の役割をしていることを明らかにしている。したがってlunaparkによるユビキチン化反応が膜解離の開始因子となり、小胞体流動を調節している可能性が考えられる。そこで本年度はlunaparkがユビキチン化する小胞体膜タンパク質の探索を行い、以下の結果を得た。
1)Lunaparkが小胞体膜タンパク質p63を選択的にユビキチン化することを見出した。
2)Lunaparkをノックダウンした培養細胞では、p63のプロテアソームによる分解が減少した。
p63は小胞体の選択的オートファジーであるERファジーを制御することが知られている。このことから、小胞体流動における膜解離因子がERファジーの調節因子と連携していると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、ERファジーの調節因子として知られるp63がlunaparkにより選択的にユビキチン化されること、lunaparkによるユビキチン化によりp63がプロテアソームで分解されることを見出した。本年度の知見は小胞体流動とERファジー、とりわけ小胞体流動における膜解離の開始過程とERファジーの終結過程がlunaparkとp63を介して予想外にも密接に関わっていることを示唆している。Lunaparkが局在するthree-way junctionは小胞体流動とERファジーの両方を制御する場として機能している可能性がある。ERファジーは小胞体の恒常性を維持するために小胞体の一部を分解する現象であるが、three-way junctionにおけるlunaparkとp63の解析をさらに進めることで、小胞体流動における全く新しいERファジーの役割の解明に繋がる可能性がある。このように小胞体流動に関わる新しい分子と知見が得られたので、本研究は概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
小胞体の構造制御タンパク質の膜挿入装置を組み込んだ小胞体脂質組成(41% POPC, 32% DPPE, 12% DOPS, 5% PI, 10% 蛍光色素PKH-26でラベルしたcholesterol)の蛍光ラベルした人工リポソームを作成する。その上にin vitro translationしたFLAGタグ付きあるいはHAタグ付きの小胞体の構造制御タンパク質をそれぞれATP存在下でincubateし、人工リポソームに膜挿入する。その後、炭酸ナトリウム洗浄により挿入されていないタンパク質を洗い、人工リポソームを回収する。それぞれのタグの抗体を用いて染色し、人工リポソーム膜を共焦点レーザー顕微鏡で観察する。それぞれの小胞体の構造制御タンパク質が、集積、分離しているかを観察する。さらには、タイムラプス顕微鏡を用いて、小胞体の構造制御タンパク質の分離、集積による人工リポソームの変形、動きを観察する。
小胞体の構造制御タンパク質の膜解離因子による小胞体の構造制御タンパク質の状態を、上述の人工リポソームの実験系を用いて検証・確認する。
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