2021 Fiscal Year Research-status Report
膵β細胞におけるグルコース応答性インスリン翻訳調節機構の解明
| Project/Area Number |
21K06841
|
|---|
| Research Institution | Nara Medical University |
|---|
Principal Investigator |
山内 晶世 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (70361110)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | インスリン / 翻訳制御 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
インスリンは膵臓のβ細胞から分泌される、血糖値（血液中のグルコース濃度）を調節するホルモンである。β細胞はグルコース濃度の上昇に応答してインスリンを分泌するとともに、インスリンの生合成を増加させ、分泌によって減少したインスリンを補充する。グルコースによるインスリン生合成の増加は、インスリンmRNA からタンパク質を合成する翻訳の増加に依存しているが、その分子機構は不明である。本研究の目的は、インスリンのグルコースによる翻訳制御に必要な遺伝子領域を明らかにすることである。
本研究では、β細胞におけるインスリンのグルコースによる翻訳制御に重要であると考えられているインスリン遺伝子の非翻訳領域 (UTR) を改変し、インスリン生合成に与える影響を評価する。これまでヒトのβ細胞の培養細胞ではグルコース応答性インスリン生合成は観測されていないため、マウスβ細胞株である MIN6 細胞を用いることにした。まず、インスリンmRNAの量は変動せずに翻訳が増加するようなグルコース濃度と刺激時間を決定した。マウスにはインスリン遺伝子が2つ (Ins1とIns2) 存在し、それぞれのmRNAの翻訳のグルコース依存性の評価は、もう片方のインスリン遺伝子を欠損させたMIN6細胞で行う必要がある。また、両遺伝子のUTRの配列には、相同性が高い領域もあるが、異なる領域もあるので、改変するUTR領域の選択には、両遺伝子のグルコース応答性が同じかどうかを明らかにすることが必要である。そこで、Ins1欠損MIN6細胞およびIns2欠損MIN6細胞の作製に着手し、現在進行中である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マウスMIN6細胞でグルコースによってインスリンのmRNAは増加せずに生合成が増加する条件を見いだすことができたが、2つのインスリン遺伝子それぞれについてグルコース応答性を評価する必要があるため、CRISPR/Cas9によるゲノム編集を用いて、Ins1欠損MIN6細胞およびIns2欠損MIN6細胞を作製しようとしたが、成功しなかった。現在、ゲノム編集方法を変更して、これらの細胞を作製中であり、インスリン生合成のグルコース依存性の測定には至っておらず、実施計画よりやや遅れている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
Ins1欠損MIN6細胞およびIns2欠損MIN6細胞の作製を完了する。それぞれの細胞について、野生型のMIN6細胞で最適化した培養条件やグルコース刺激条件において、mRNA量の変化はないことを確認したあと、インスリン生合成を測定する。どちらの細胞でもグルコースによってインスリン生合成が増加したら、両遺伝子のUTRで配列が共通する領域をゲノム編集により改変する。Ins2 UTR改変Ins1欠損MIN6細胞およびIns1 UTR改変Ins2欠損MIN6細胞のインスリン生合成のグルコース応答性を測定して改変領域の重要性を評価する。片方の遺伝子にしかグルコース応答性が見られなかった場合は、その遺伝子特有の領域を改変した細胞を作製し、インスリン生合成のグルコース応答性を測定して改変領域の重要性を評価する。これにより、インスリン生合成のグルコースによる制御に必要なインスリン遺伝子の領域を明らかにする。
|
| Causes of Carryover |
Ins1欠損MIN6細胞およびIns2欠損MIN6細胞の作製が完了せず、インスリン生合成測定に必要なラジオアイソトープ (RI) 試薬やインスリン検出用試薬などを購入しなかったため、次年度使用額が生じた。
次年度使用額および当該年度以降分の助成金は、Ins1欠損MIN6細胞およびIns2欠損MIN6細胞のインスリン生合成測定のためのRI試薬・インスリン検出用試薬の購入費、UTR改変MIN6細胞の作製およびそれらの細胞のインスリン生合成測定に必要な細胞培養用試薬・分子生物学用試薬・RI試薬・インスリン検出用試薬・器具などの購入費、研究成果を学会発表するための旅費として使用する予定である。
|
