膵β細胞におけるグルコース応答性インスリン翻訳調節機構の解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06841
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 山内 晶世 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (70361110)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: インスリン

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、β細胞におけるインスリンのグルコースによる翻訳制御に重要であると考えられているインスリン遺伝子の非翻訳領域 (UTR) を改変し、インスリン生合成に与える影響を、マウスβ細胞株であるMIN6細胞を用いて評価することを計画した。マウスの２つのインスリン遺伝子 (Ins1とIns2) それぞれのグルコース応答性を調べる必要があるため、ゲノム編集を用いたIns1欠損MIN6細胞およびIns2欠損MIN6細胞の作製を行った。しかし、それぞれの遺伝子のヘテロ欠損細胞は得られたが、これらにゲノム編集を繰り返してホモ欠損細胞を得ることができなかったため、計画の変更が必要となった。
グルコースに応答したインスリンの翻訳は加齢に伴い減少するが、その機構は不明である。老化の特徴のひとつにオートファジーの低下が挙げられる。β細胞特異的オートファジー不全マウスの膵島では、グルコース応答性インスリン分泌は低下する。オートファジーの低下はカリウムイオン刺激によるインスリン分泌には影響しないため、オートファジーはグルコース応答性インスリン生合成や分泌の過程そのものに関与していると考えられる。そこで、オートファジーがグルコース応答性インスリン翻訳を制御するかどうかを明らかにし、制御するならば、その機構を解明することにした。まず、MIN6細胞を高グルコースで刺激したところ、オートファジーが増加した。そこで、MIN6細胞において、オートファジーに必須の遺伝子であるAtg7をノックダウンしてグルコース応答性インスリン分泌を解析しようとしたが、Atg7のノックダウン効率が低く、評価できなかった。現在、Atg7遺伝子をノックアウトしたMIN6細胞を作製している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

マウスMIN6細胞の2つのインスリン遺伝子それぞれについてグルコース応答性を評価する必要があるため、Ins1欠損MIN6細胞およびIns2欠損MIN6細胞を作製しようとしたが、できなかった。したがって、UTRを改変して解析するという当初の計画の変更が必要となったため、研究課題の進捗としては遅れている。

Strategy for Future Research Activity

Atg7遺伝子をノックアウトしたMIN6細胞の作製を完了する。MIN6細胞においてAtg7遺伝子をノックアウトすると、グルコース応答性インスリン分泌が低下することが予想されるので、作製したAtg7ノックアウトMIN6細胞のグルコース応答性インスリン分泌を測定し、野生型のMIN6細胞と比較する。Atg7ノックアウトMIN6細胞でグルコース応答性インスリン分泌が低下することを確認後、グルコース応答性インスリン生合成を測定し、野生型MIN6細胞と比較する。両者に差があれば、発現に差のある遺伝子のうち翻訳制御に関わる可能性のある遺伝子を抽出する。それらの候補遺伝子のノックアウトや過剰発現がグルコース応答性インスリン生合成に与える影響を解析することで、MIN6細胞のグルコース応答性インスリン翻訳調節機構を解明する。

Causes of Carryover

Ins1欠損MIN6細胞およびIns2欠損MIN6細胞の作製が完了せず、インスリン生合成測定に必要なラジオアイソトープ (RI) 試薬やインスリン検出用試薬などを購入しなかったため、次年度使用額が生じた。
次年度使用額は、Atg7遺伝子をノックアウトしたMIN6細胞の作製およびインスリン分泌や生合成の測定のための分子生物学用試薬・細胞培養用試薬・RI試薬・インスリン検出用試薬・器具などの購入費、研究成果を学会発表するための旅費、論文投稿費として使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Intermittent hypoxia increased the expression of ESM1 and ICAM-1 in vascular endothelial cells via the downregulation of microRNA-181a1. (2024)
  • Author(s): Takasawa S, Makino M, Yamauchi A, Sakuramoto-Tsuchida S, Hirota R, Fujii R, Asai K, Takeda Y, Uchiyama T, Shobatake R, Ota H.
  • Journal Title: J Cell Mol Med. Volume: 28(1) Pages: e18039
  • DOI: 10.1111/jcmm.18039.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Up-regulation of ICAM-1 and ESM 1 by intermittent hypoxia via down-regulation of microRNA-181a1 in vascular endothelial cells. (2023)
  • Author(s): Takasawa S, Makino M, Yamauchi A, Sakuramoto-Tsuchida S, Hirota R, Fujii R, Asai K, Takeda Y, Uchiyama T, Shobatake R, Ota H.
  • Organizer: The 59th EASD Annual Meeting (Hamburg, Germany)
  • Int'l Joint Research