2022 Fiscal Year Research-status Report
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21K06843
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
鈴木 歩 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (80639708)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥田 晶彦 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (60201993)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | Max / 減数分裂の開始機構 / 体細胞分裂 / MYC / MGA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
卵子や精子などを作りだす元となる生殖細胞の幹細胞(男性では生殖幹細胞、女性は始原生殖細胞)は、体細胞分裂を繰り返してその数を増やすが、適切なタイミングになると、染色体の本数を半減させるための減数分裂が開始される。興味深いことに、減数分裂の開始のタイミングというのは、いつ子孫を残すのかということとリンクするため、生物種にとって生き残りをかけた進化の仕組みが如実に反映される傾向があり、種によってその分子機構はさまざまである。哺乳類ではどのように減数分裂が開始されるかはほとんどわかっていない。
我々は以前より、Max遺伝子が減数分裂の遺伝子の抑制に関わっていることをES細胞のノックアウト実験より見出している。具体的には、Maxタンパク質はMycタンパク質と結合すると体細胞分裂を促進する機能をもつ一方で、Mgaタンパク質と結合すると減数分裂遺伝子の抑制に働くと考えている。しかしながら生体内で実際にMaxが減数分裂遺伝子の抑制に関わっているかどうかは明らかではない。そこで本研究ではMaxという遺伝子に着目し、哺乳類生殖細胞の減数分裂の開始機構を明らかにしようと試みている。
2022年度はMaxを野生型およびコンディショナルにノックアウトもしくは過剰発現した生殖細胞を回収してtranscriptome解析およびChIP-seq解析を試みた。しかしながら、細胞数の確保と生殖細胞のみを回収する精製度の向上が課題となることがわかったため、生殖細胞特異的にMax遺伝子がノックアウトされたり、過剰発現されると緑色から赤色の蛍光タンパク質を発現するマウスを開発し、現在、蛍光標識によるセルソーティングにより、目的の細胞のみを高効率で回収する手法の開発を試みている。また同様の仕組みで、MYC/MAXの過剰発現を生殖細胞で行えるマウスも開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MYC/MAXもしくはMGA/MAXの制御下にあって、減数分裂開始に関与する可能性のある候補遺伝子を同定するために、性分化前のPGC(胎生11.5日)と性分化後(胎生13.5日)のPGCを細胞表面抗原であるSSEA1に対する抗体を用いて回収し、その後、MYC,MAX,MGAに対する抗体を用いてqPCR法によって候補遺伝子のTSSにこれらの遺伝子が結合するかどうかを評価した。その結果個体ごとのばらつきが多いことや、検出感度が低く、そもそも細胞数が少なく、また生殖細胞表面マーカーであるSSEA1に対する磁気ビーズ付き抗体を用いた回収方法では、生殖細胞以外の細胞も一定数混入していることが明らかとなった。したがってこの手法では、MAXのコンディショナルノックアウト実験や過剰発現実験における解析にも少なくない影響をあたることが予想された。そこでRosa26遺伝子座にloxPに挟まれたGFP遺伝子の下流にRFP遺伝子をもつR26GRRマウスを導入し、Oct4-CreERT2マウスと交配することによって、生殖細胞特異的に発現するOct4遺伝子の制御領域下でドライブされるCreERT2によって、タモキシフェン依存的に、loxPに挟まれた領域が組み変わった場合に、細胞が緑から赤へと変化する遺伝子組み換えマウス系統を作製した。またこのマウスとMaxコンディショナルマウスやMax KIマウスと交配することにより、Maxがノックアウトされたり過剰発現された場合に生殖細胞のみがタモキシフェン依存的に赤く光るマウスも作製したほか、MYC-MAXを同時に過剰発現することが可能なマウスも作製した。
上記のような進捗が遅れる事情があった一方で、生殖細胞特異的な発現を可能にするMaxの上流配列欠失させたマウスは、その表現形の解析について順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
上項のマウスシリーズを準備できたことにより、今後大まかな目標としていた３つの項目、MYC/MAXもしくはMGA/MAX (PRC1.6)の制御下で減数分裂の開始に関わる遺伝子の同定、減数分裂前にMAXが消失するメカニズムの解明、減数分裂開始におけるMYC/MAXの機能低下の必要性の検討について実験結果を出すことが可能になったと思われる。
今後は、セルソーティングにより目的細胞を効率的に回収する条件を検討する他、MaxのノックアウトやMYC/MAXの過剰発現が減数分裂の開始にどのような影響を与えるかを評価したい。
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| Causes of Carryover |
2022年度の使用計画では、次世代シーケンサー（NGS）解析が想定されいたが、生殖細胞の採取効率を高める必要性から、目的のマウスモデルを作製するためのマウスの導入と交配に多大な時間と資源を割いた。その結果、本来NGS解析に充てられるはずだった配分予算が十分に活用されず、翌年度に繰り越されることになった。したがって繰り越された予算は、セルソーティングによる細胞回収技術の向上とNGS解析の実施という2つの大きな目的に配分される予定である。
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