2021 Fiscal Year Research-status Report
ミトコンドリアtRNA修飾核酸の網羅的測定による新規ミトコンドリア病診断法の確立
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21K06865
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
秋山 泰利 東北大学, 薬学研究科, 助教 (70635557)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
豊原 敬文 東北大学, 医工学研究科, 特任講師 (60594182)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 修飾核酸 / ミトコンドリア病 / tRNAs |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、(1)ミトコンドリアからのtRNAsの効率的な抽出、(2) ミトコンドリア病患者から樹立したヘテロプラスミーの異なるiPS細胞クローンからの心筋誘導、(3) LC-MS/MSによる修飾核酸の一斉定量、の3項目を大きな柱としている。ミトコンドリアtRNAsの抽出に関しては最適化を進め、まず培養細胞のtotal RNAを用いてtRNAs特異的なプルダウンによるtRNAs抽出法の確立を行なった。さらにミトコンドリアRNAの簡易かつ効率的な精製の条件検討を行ない、前述のtRNAs抽出法がミトコンドリアtRNAsに対しても同様に効率よく行えることを確認した。iPS細胞からの心筋への誘導はクローンごとの誘導効率の差異が認められることから、クローン間の誘導効率の均一性を上昇させるためにさらなる検討を進めている。LC-MS/MSの測定系では、一斉定量可能な修飾核酸種の拡充を進めており、τm5s2U, ms2i6A, τm5U, f5Cといったミトコンドリア特異的な修飾核酸も測定系に加えることができた。実際ミトコンドリアRNAを培養細胞から抽出し、サンプル調整を行い測定を行うことで、これらの修飾核酸の検出および定量に成功した。
申請者の考案したtRNAsの濃縮法は、tRNAsの高次構造（tRNAの3'-CCA末端）特異的に結合するDNAオリゴと成熟tRNAsを連結させるものである。本研究の予備検討としてこの手法の最適化を行い、さらにこの手法を用いて、tRNAsの3'-CCA末端が細胞のストレスにより切断されることを明らかにした。以上の結果は本研究の重要な基礎データとなるものであり論文として報告を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記の通り、本研究の主要3項目である、ミトコンドリアからのtRNAsの効率的な抽出、iPS細胞クローンからの心筋誘導、LC-MS/MSによる修飾核酸の一斉定量の、いずれの項目においても概ね予定通りの進捗状況となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続きミトコンドリアtRNAs抽出効率のさらなる改善、iPS細胞の心筋への分化の再現性、分化効率の上昇、さらにLC-MS/MSでの測定可能な修飾核酸種の拡充、感度の上昇などにつき進めていく。まずは培養細胞からのミトコンドリアtRNAs精製により、確実にミトコンドリアtRNAsの修飾核酸プロファイルが得られるようにすることを第一の目標とする。ミトコンドリアtRNAs修飾核酸プロファイル測定系の確立後、iPS細胞を心筋に分化させたサンプルを用いて、実際のミトコンドリア病の心筋における修飾核酸プロファイルの解明と、その病態への影響を検討していく予定である。
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