Construction of Multiple Sample Analysis System Using FRET System and Search for Inhibitors of Virus Polymerization Proteins

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06872
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 上 大介 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80415588)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 秋光 信佳 東京大学, アイソトープ総合センター, 教授 (40294962) ; 五條 理志 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90316745)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: FRET / 阻害剤 / 多検体解析 / ウイルス由来重合タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

RNAウイルスSARS-CoV-2は世界中で大流行し、治療薬の開発競争が激化している。治療薬のターゲット分子はウイルスの表面抗原やRNAポリメラーゼが多く、細胞内で増加したウイルスゲノムRNA除去を目指した治療薬開発は報告がない。このゲノムRNAはNucleocapsid protein (N protein)と結合、さらにN protein同士で重合することで、細胞内で安定化する。本研究はSARS-CoV-2のN proteinの重合を阻害する低分子化合物をハイスループットシステムにて探索し、重合阻害の有効性をvitroにて証明することを目的としている。そこで我々は重合化を評価できるFRETシステムとイメージングサイトメータを用いたシステムを設計・構築した。このシステムを用いて、重合阻害を可能にする低分子化合物を探索し、そのゲノムRNAの安定性をvitroにて解析する。これらの結果と解析システムの構築はN proteinをもつ数多くのウイルスに対する新たな治療薬の開発の先駆的な手法となりえる。
今年度は前年度で問題点を解決した新しいベクター構築を行い、その評価を行ってみたが、予定の結果は得られなかった。そこでレトロウイルスを用いて安定発現株を樹立し、シングルセルクローニングを行った。取得した細胞はIn Cell Analyzer2200にて撮像し、FRETのポジティブコントロール、ネガティブコントロール株と比較した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

FRETの構築は完成したが良好な結果はだせなかった。そこで新たにEGFPを融合した全長N proteinを設計した。N proteinはN protein同士が重合して大きくなるため、EGFPと融合したN proteinは大きな塊となる。このEGFP-N proteinをHAタグで精製し、in vitroでの重合が起きるかを検討したところ、蛍光顕微鏡下で複数の蛍光発色している塊が確認できた。この系をおいた大学より供与いただいた薬剤と反応させて塊の数をカウントして評価することとした。

Strategy for Future Research Activity

新しく立ち上げた系にて蛍光発色の塊をカウントし、薬剤のスクリーニングに利用する。

Causes of Carryover

想定より実験に必要な消耗品費を抑えられたため、次年度の実験用に充てる。