Construction of Multiple Sample Analysis System Using FRET System and Search for Inhibitors of Virus Polymerization Proteins

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K06872
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 上 大介 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任講師 (80415588)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 秋光 信佳 東京大学, アイソトープ総合センター, 教授 (40294962) ; 五條 理志 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90316745)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: LLPS / SARS-CoV-2 / N protein / In Cell Analyzer

Outline of Annual Research Achievements

RNAウイルスSARS-CoV-2は世界中で大流行し、治療薬の開発競争が激化している。治療薬のターゲット分子はウイルスの表面抗原やRNAポリメラーゼが多く、細胞内で増加したウイルスゲノムRNA除去を目指した治療薬開発は報告がない。このゲノムRNAはNucleocapsid protein (N protein)と結合、さらにN protein同士で重合することで、細胞内で安定化する。本研究はSARS-CoV-2のN proteinの重合を阻害する低分子化合物をハイスループットシステムにて探索し、重合阻害の有効性をvitroにて証明することを目的としている。そこで我々は重合化を評価できるFRETシステムとイメージングサイトメータを用いたシステムを設計・構築したが、良好な結果はだせなかった。そこで新たにHAタグとEGFP、全長N proteinを融合したタンパク質（EGFP-N protein）を設計した。このEGFP-N proteinをHA抗体にて精製し、vitroにてLLPS反応が起き、複数の蛍光塊が形成される系の構築に成功した。そこで、この系に大分大学から供与いただいたアルカロイド系低分子化合物200種を反応させ、LLPS反応に変化がある薬剤を選択して評価を試みた。この結果11化合物はLLPS形成率が半減することを明らかにした。更にこれらの化合物とEGFP-N proteinを強制発現させたHEK293FT細胞と反応させ、In Cell Analyzerによる網羅解析を試みたところ、３化合物にてLLPS形成率に変化があることを証明できた。N proteinの重合阻害はウイルス合成阻害となりえるためこれらの結果と解析システムの構築はN proteinをもつ数多くのウイルスに対する新たな治療薬の開発の先駆的な手法となりえる。