2021 Fiscal Year Research-status Report
Identification of apoE-related glomerulopathy using renal biopsy specimens.
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21K06930
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
長濱 清隆 杏林大学, 医学部, 講師 (00336538)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福冨 俊之 杏林大学, 医学部, 助教 (30439187)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | apoE / 糸球体腎炎 / 糸球体沈着症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画では、過去の腎生検検体を用いて免疫染色等によりapoEの沈着の有無について検討し、後方視的に新たなapoE関連腎症を同定し、その予後をすることを目的としている。令和3年度は、症例の蓄積およびAPOE遺伝子型の解析が主たる目標であった。実験を開始するにあたり、まずは杏林大学医学部倫理委員会からの実験計画に関する承認を取得した。APOE遺伝子型の同定のため、腎生検検体パラフィン切片から核酸を抽出し、real time PCRにて行う予定であったが、複数個の検体で試行したところ安定した結果を得ることができなかった。そこでより確実な結果を得るために、Sanger sequenceにより塩基配列を決定することとした。しかしながら、複数の組み合わせのプライマーを用いて検討したが、遺伝子配列決定が可能なPCR産物を得ることができなかった。今後、パラフィン切片から抽出する核酸量の増加やPCRに関する条件検討を行い、APOE遺伝子を解析する方法を模索する。一方、症例については杏林大学医学部付属病院の過去10年分の腎生検検体の中から、膜性腎症と診断された症例を再評価し、蛍光免疫染色上、免疫複合体が確認されない症例を抽出した。これらの症例について、apoEの免疫染色を行った結果、2例において糸球体にapoEの沈着が疑われた。今後、これらについて質量分析や免疫電顕などにてapoEの沈着を確認すると同時に、診療録上の臨床データ等を参照し腎予後について検討を行う。また、膜性腎症以外の疾患で、光顕上、免疫複合体の沈着が示唆される疾患で、蛍光免疫染色上、沈着が見られない症例についての検索を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
上記概要に記載した通り、real-time PCRを用いた遺伝子解析を予定していたが、パラフィン切片から抽出したDNAを用いた検討では安定した結果を得ることができなかった。このため、遺伝子異常の検出を兼ねて、Sanger sequenceを用いて遺伝子配列を決定する方法へと変更した。遺伝子配列の決定は、研究代表者が関与したapoE関連腎症に関する症例報告（Case Rep Nephrol Dial 8: 45-55, 2018）を基に行ったが、これは患者血液を用いた解析であり、パラフィン切片から抽出したDNAにはそのまま応用できず、PCRにて増幅する塩基配列数やプライマーの変更が必要と思われた。APOE遺伝子の変異を同定するためには、より広範な範囲での遺伝子解析が必要で、さらに複数のプライマーを検討して同定を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
より多くのプライマーを設定し、ApoEの遺伝子型だけではなく、変異の有無を確認する。また、杏林大学医学部付属病院の検体のみではApoE関連腎症と考えられる症例が乏しいため、関連病院との連携を深め、症例を増やし、疑い例に対しては免疫染色のみならず、質量分析を用いてApoE沈着の有無を確認する。
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| Causes of Carryover |
ApoEの遺伝子型解析が当初の予想以上に困難で、想定よりもPCRの頻度が低かった。また、共同研究者が使用する予定であった質量分析器が故障したため、質量分析で使用する予定の消耗品を購入する必要がなかった。ApoEの遺伝子型解析は条件が整い次第、直ちに多検体の核酸解析を行う予定で、そのための消耗品を次年度に購入する。質量分析器も修理が終了次第、必要な消耗品を購入する予定である。
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