2021 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of Cell-cell interaction models with CRISPR library
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21K06945
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
倉田 盛人 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (40451926)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 薬剤耐性 / CRISPR screening / 細胞間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
癌幹細胞は「微小環境」にて癌の維持に働いており、この微小環境内での癌幹細胞と間質細胞の相互作用ががんの増殖や薬剤耐性に関与することも知られているが、その詳細な機序については不明な点も多い。我々はCRISPR Knockout Libraryを用いてランダムな変異を支持細胞に誘導し、腫瘍細胞と共培養することで、細胞間相互作用により腫瘍細胞が微小環境様の薬剤耐性を獲得する実験系を確立した。本実験においては支持細胞としてHEK293T、腫瘍細胞として白血病細胞株U937、膵癌細胞株MIA PaCa-2、抗がん剤としてCytarabine、Gemcitabineを使用し、HEK293Tと腫瘍細胞を共培養後に抗癌剤に曝露した。HEK293TとU937の共培養実験では、変異のないHEK293Tと培養した場合U937はCytarabine下で大部分が死滅したが、一部の”変異HEK293T”と接着していたU937は同濃度のCytarabine下でも生存・増殖した。この”変異HEK293T”を分離、ガイドRNAを解析することで、薬剤耐性誘導に関連する可能性のある候補として約40種の遺伝子を同定した。これらの各候補遺伝子をノックアウトした “変異HEK293T”を改めて作成し、それらと共培養したU937・MIA PaCa-2が抗癌剤曝露下でも有意に生存・増殖することが再現性をもって確認された。結果、C9orf89, MLPH, MAGI2, RHBDD2において、生物学にも薬剤耐性を誘導できることが確認出来た。また、膵癌手術症例において癌周囲間質における4種の候補遺伝子の発現と予後の相関について評価を行った結果、候補遺伝子のMAGI2とRHBDD2の発現低下にて、予後不良であることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
候補遺伝子の確認実験において、予想より高い確率にて再現性が得られている。結果、一部の候補遺伝子においては、臨床検体を用いた解析に到達できた。ただし、in vivoでの薬剤耐性確認の為の動物実験においては、やや準備が遅れている。全体としては、概ね予定通りに進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、in vivoでの候補遺伝子の機能確認の為、ヌードマウス用いた検証を行う。普遍性が確認された候補遺伝子は、ヌードマウスの皮下に候補遺伝子をノックアウトした細胞と腫瘍細胞を混合したセルペレットを移植し、抗癌剤投与における腫瘍径を測定し、薬剤耐性について検討する。
また、同定された候補遺伝子において、治療ということを視野に入れた場合には、候補遺伝子の過剰発現が薬剤感受性に寄与することが期待される。耐性メカニズムの解明と共に、対象候補分子のアゴニストとして働く既存の化合物を同定する。また、その発現を上流で発現を負に制御する分子が同定される候補遺伝子では、その阻害剤が治療候補の分子となりうることを検証する。
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| Causes of Carryover |
動物実験の準備に遅れが生じたことにより、初年度に準備が完了できなかった為。飼育条件を変更するなどして、2022年度にin vivoでの薬剤耐性確認実験を行うこととする。
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