2021 Fiscal Year Research-status Report
RNA activationにおける分子機構の解析
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21K06953
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
大野 慎一郎 東京医科大学, 医学部, 講師 (90513680)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
熊谷 勝義 東京医科大学, 医学部, 助教 (20567911)
黒田 雅彦 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (80251304)
原田 裕一郎 東京医科大学, 医学部, 助手 (80570168)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | DDX21 / AGO / TNRC6 / RNA activation |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、これまでの研究過程で発見した、miR-34aによるがん抑制遺伝子ZMYND10の発現誘導をRNA activation (RNAa)機構の評価系として、この現象に関わる分子群を同定し、RNAa現象の普遍的な分子メカニズムを明らかにする。この研究目的を達成するために、はじめにプロテオーム解析による核内AGO/TNRC6複合体の解析を実施した。核内miRNAは、細胞質中のmiRNAと同様にAGO/TNRC6と複合体を形成して機能する。RNAaの際には、miRNA/AGO/TNRC6複合体がさらに何らかの転写活性化因子と結合し、プロモーターを活性化させていると考えられる。したがって、核内AGOおよびTNRC6の共免疫沈降により、核内AGO/TNRC6と複合体を形成する転写因子の同定を試みた。転写因子の探索は、LC-MS/MS (DIA)プロテオーム解析を用いた。結果、核内AGO/TNRC6と複合体を形成する多数のタンパク質を同定し、特にAGOおよびTNRC6の両方に強く結合するタンパク質としてRNAヘリカーゼの一種であるDDX21を同定した。続いて、DDX21のRNAaにおける機能を明らかにするためにCRISPR/Casを用いてDDX21遺伝子欠損細胞株を作製した。作成したDDX21欠損細胞株を用いて、miR-34aによるRNAaを評価した結果、DDX21欠損細胞株ではRNAaが顕著に低下しており、またこの低下はDDX21発現ベクターの導入により回復した。加えて、このDDX21欠損細胞株では、miR-34aのRNA干渉標的であるAXLおよびMETのノックダウンに影響はなかったことから、DDX21はmiR-34aのRNAaにのみ関与していることが示された。以上のように、核内AGO/TNRC6と複合体を形成し、RNAaに重要なタンパク質としてDDX21を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
ここまでの研究で我々は、核内AGO/TNRC6複合体を形成し、RNAaに重要なタンパク質としてDDX21を同定した。DDX21はrRNAの合成に関わるRNAヘリカーゼであり、転写因子としての機能は報告されていない。このことから、DDX21は核内AGO/TNRC6を中核とするRNAa複合体を構成する重要な因子であるが、直接的な転写活性化因子は別に存在すると考えられる。したがって今後は、核内AGOおよびTNRC6の共免疫沈降とプロテオーム解析により同定した、核内AGO/TNRC6と複合体を形成するタンパク質群の中から、直接的に転写活性化に作用する転写因子を探索する。RNAaは、RNA干渉と同様にAGO/TNRC6複合体が使われるため、候補転写因子の機能解析には、RNA干渉を用いることができない。実際に、RNAaとRNA干渉を同時に誘導すると、各々が拮抗的に阻害されることを確認している。したがって、候補となる転写因子の機能解析は、CRISPR/Casによる遺伝子欠損細胞株を作製して検証する。また、すでに同定済みのDDX21に関しては、共免疫沈降実験だけでは、複合体形成の解析としては不十分であるため、RNAaにおける機能の重要性が確認できた転写因子に関して、AGO/TNRC6複合体に対する相互作用解析を行う。具体的には、タグを付加したAGO、TNRC6およびDDX21の発現細胞株を作成し、プルダウンアッセイにより、結合ドメインを明らかにする。以上により、RNAa複合体の解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
若干の次年度使用額が生じたが、大きい額ではなく計画通りである。
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