2022 Fiscal Year Research-status Report
筋衛星細胞における機能維持メカニズムのグローバル解析
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21K06961
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| Research Institution | National Center of Neurology and Psychiatry |
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Principal Investigator |
林 晋一郎 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 疾病研究第一部, 室長 (10732381)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 骨格筋 / 筋幹細胞 / Pax7 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
筋ジストロフィーの根本的治療法の一つとして、骨格筋幹細胞(筋衛星細胞)を用いた再生医学的治療法が挙げられる。移植された筋幹細胞は増殖・分化・融合 して筋再生に寄与するだけでなく、その一部は移植先の筋組織内で再び休止状態となり、組織幹細胞として定着することができる。しかしながら生体外で幹細胞 機能を維持したまま増幅させることが困難なことや移植後の定着率の低さなど乗り越えるべき課題も多く、実現に至っていない。Pax7は筋幹細胞で発現する転写因子であり、筋幹細胞の機能維持に必須であるが、その共役因子、標的因子、および発現制御機構については殆ど明らかにされていない。そこで、本研究では、 申請者が作製したPax7にHAタグを付加したノックインマウス(Pax7-HA KIマウス)を活用し、筋幹細胞におけるPax7の転写調節共役因子および標的因子を明らかにすることで骨格筋幹細胞の機能調節・機能維持メカニズムを明らかにすることを目的とした。今年度はPax7-HA KIホモ胚（E12.5）の体節を用いて、 抗HA抗体を用いた免疫沈降-質量分析法によりPax7結合タンパク質を網羅的に解析した。その結果、クロマチン制御因子を含むこれまで報告のない324種のタンパク 質を同定した。さらに、昨年度行ったPax7-HA KIホモマウス由来の筋幹細胞を用いた免疫沈降-質量分析法の結果を合わせて解析し、両者で共通するタンパク質を34種同定した。本研究の進展に伴い、骨格筋幹細胞の増殖・分化制御、筋形成の全容が解明されるとともに、その成果が再生医療へと応用されることが強く期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
抗HA抗体を用いた免疫沈降-質量分析法により特定したタンパク質の確認のため、免疫沈降-ウェスタンブロット法による確認を行ったが、現在までにPax7との結合が見られたものは得られていない。この理由として、①Pax7-HAの発現量が少なく、高感度の免疫沈降-質量分析法ではバックグラウンドを拾っていた可能性があること、②購入したPax7共役因子候補タンパク質の抗体がうまく反応していないことが考えられる。また、単離したPax7-HA筋幹細胞で抗HA抗体を用いたChIP-seqを行っているが、免疫沈降得られるDNA量が充分でなくシークエンスを行える状況にない。
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| Strategy for Future Research Activity |
抗HA抗体を用いた免疫沈降-ウェスタンブロット法による解析については、新たな抗体を購入し再度解析を行う。Pax7との結合が確認でき次第、過剰発現およびsiRNAによる発現抑制をした時の筋幹細胞の増殖・分化を解析する。また、E10.5-E12.5胚および筋幹細胞において、免疫蛍光染色により当該因子とPax7との共局在を解析する。ChIP-seqに関しては微量のDNAからライブラリ作製可能なキットを用いて行うことを検討している。
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[Journal Article] RNA-seq analysis, targeted long-read sequencing and in silico prediction to unravel pathogenic intronic events and complicated splicing abnormalities in dystrophinopathy2022
Author(s)
Okubo M, Noguchi S, Awaya T, Hosokawa M, Tsukui N, Ogawa M, Hayashi S, Komaki H, Mori-Yoshimura M, Oya Y, Takahashi Y, Fukuyama T, Funato M, Hosokawa Y, Kinoshita S, Matsumura T, Nakamura S, Oshiro A, Terashima H, Nagasawa T, Sato T, Shimada Y, Tokita Y, Hagiwara M, Ogata K, Nishino I
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Journal Title
Human Genetics
Volume: 142
Pages: 59～71
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Intranuclear inclusions in skin biopsies are not limited to neuronal intranuclear inclusion disease but can also be seen in oculopharyngodistal myopathy2022
Author(s)
Ogasawara Masashi,Eura Nobuyuki,Nagaoka Utako,Sato Tatsuro,Arahata Hajime,Hayashi Tomohiro,Okamoto Tomoko,Takahashi Yuji,Mori‐Yoshimura Madoka,Oya Yasushi,Nakamura Akinori,Shimazaki Rui,Sano Terunori,Kumutpongpanich Theerawat,Minami Narihiro,Hayashi Shinichiro,Noguchi Satoru,Iida Aritoshi,Takao Masaki,Nishino Ichizo
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Journal Title
Neuropathology and Applied Neurobiology
Volume: 48
Pages: e12787
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Multi-dimensional analyses of the pathomechanism of GNE myopathy with non-catalytic site variant, GNE: c.620A>T.2022
Author(s)
Yoshioka W, Iida A, Sonehara K, Yamamoto K, Oya Y, Mori-Yoshimura M, Kurashige T, Okubo M, Ogawa M, Matsuda F, Higasa K, Hayashi S, Nakamura H, Sekijima M, Okada Y, Nishino I, Noguchi S
Organizer
MYOLOGY 2022
Int'l Joint Research
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