2022 Fiscal Year Research-status Report

ボツリヌス症を治療するヒト型抗体製剤の開発に向けた基盤研究

Research Project

Project/Area Number	21K07021
Research Institution	Kanazawa University
Principal Investigator	松村拓大金沢大学, 医学系, 准教授 (00456930)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	ボツリヌス毒素 / 神経毒素 / ボツリヌス症 / ヒト型抗体 / 抗体カクテル
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、ヒトにボツリヌス中毒を起こすボツリヌス毒素に対する安全で高い中和力価を持ち、なおかつ生産効率の良い抗毒素抗体（ヒト型抗体）製剤セットの作出を目指す。これまで、B型ボツリヌス毒素（BoNT/B）を中和するヒト型抗体M2およびM4の中和機構を解析し、M4はBoNT/Bの神経細胞への結合を阻害し、M2はBoNT/Bの神経細胞への結合、基質（VAMP2）切断以外の過程を阻害していることを明らかにしている。M2は活性ドメイン（軽鎖）の小胞内から細胞質への移行（トランスロケーション）を阻害している可能性が考えられたため、その過程を解析する実験系の構築を試み、リポソームを用いたアッセイ方法を検討中である。 A型ボツリヌス毒素(BoNT/A)に対するヒト型抗体については4種(NT-523、NT-320、BT-015、BT-175)の抗体産生細胞が樹立されている。培養上清より抗体（IgG）を精製し、BoNT/Aとの結合をELISAで解析した結果、NT-320、BT-015、BT-175はBoNT/A特異的に結合し、NT-523は非特異的な結合を示すことが明らかとなった。また、Competition ELISAによりエピトープの重複を解析した結果、顕著な結合阻害は示さず、それぞれの抗体は異なるエピトープを認識していることが明らかとなった。この結果より、NT-320、BT-015、BT-175は組み合わせて使用することが可能であることが示唆された。一方で、マウスバイオアッセイにて中和活性を解析した結果、NT-320、BT-015、BT-175は単独で中和活性を示し、さらに抗体を組み合わせることにより活性が上昇することが明らかとなった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason B型ボツリヌス毒素（BoNT/B）に対するヒト型抗体M2およびM4の中和作用機序解析を進めており、M4がBoNT/Bの結合ドメインを認識し、神経細胞への結合を阻害していることを明らかにしている。M2についてはBoNT/B活性ドメインの細胞質へのトランスロケーションを阻害している可能性が示唆されたため、その解析方法を構築した。 A型ボツリヌス毒素（BoNT/A）に対するヒト型抗体については、4種NT-523、NT-320、BT-015、BT-175を培養上清から精製し、結合活性および中和活性（抗体単独および組合せでの活性上昇）を確認することができた。当初の計画通り、B型に関しては、M2およびM4のBoNT/B中和機序解析を進め、A型に関しては、BoNT/Aに対するヒト型抗体を精製し、活性を確認することができている。
Strategy for Future Research Activity	BoNT/Bに対する中和抗体M2の作用機序解析を進める。リポソームを用いたトランスロケーションアッセイを用いてM2のBoNT/B活性ドメインの細胞質移行阻害を解析する。 BoNT/Aに対する結合活性および中和活性が確認できたヒト型抗体3種NT-320、BT-015、BT-175については、BoNT/Aの各ドメイン（活性ドメイン、細胞結合ドメイン、トランスロケーションドメイン）を組換えタンパク質として発現させ、各抗体がどのドメインを認識しているのかを明らかにする。また、それぞれの抗体の作用機序についても解析する。さらに、最も高い中和効果を示す抗体の組合せを決定する。