2021 Fiscal Year Research-status Report
SARS-CoV-2増殖におけるマイクロRNAの機能解析
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21K07039
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
小野 慎子 大阪大学, 感染症総合教育研究拠点, 特任准教授(常勤) (30626437)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | miRNA / SARS-CoV-2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マイクロRNAは、細胞の恒常性の維持やがん化のみならず、感染症の病原性発現にも重要な役割を果たしている。一方、C型肝炎ウイルス（HCV）の研究から、マイクロRNAは宿主遺伝子の発現制御だけではなく、ウイルスゲノムRNAに直接結合することでウイルス増殖に影響を与えうることを示唆している。現在世界中で猛威を奮っている新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）も同じくプラス鎖一本鎖RNAをゲノムに持つことから、その増殖におけるマイクロRNAの意義を検討することを目的とした。
今年度はまず、SARS-CoV-2増殖に影響を与えうるマイクロRNAの標的配列を探索するために、siRNAスクリーニングを行った。その際、SARS-CoV-2はゲノムサイズが約3万塩基と非常に大きく変異も多く挿入されているため、コロナウイルスが合成するmRNAの5’末端に含まれる約70塩基の共通のリーダー配列を含む、保存性の高い5’UTRを標的とした。その結果、5’UTRに存在する8つのステムループ（SL）構造のうち、SL1、SL2、SL3、SL5を標的部位とするsiRNAにウイルス増殖抑制効果が認められた。また、この抑制効果は武漢株のみならず最近出現した変異株であるオミクロン株にも認められた。その領域にシード配列を持つマイクロRNAを選抜したところ、9個の候補マイクロRNAが得られた。今後は、それらを強制発現させた細胞を用いてウイルス学的解析を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
通常のSARS-CoV-2感染実験に用いられるVero細胞ではなく、トランスフェクション効率の高い293細胞をベースとした感染許容細胞である、ヒトACE2/TMPRESS2発現IFNα受容体ノックアウト293細胞を用いることで、ウイルス増殖抑制効果の高いRNAサイレンシング標的部位を効率よく同定することができた。siRNAを設計する際にin silicoで予測したものと実際の発現抑制効率は異なっていたため、ウイルスゲノムを標的としたRNAサイレンシングには、配列に加えて高次構造などの他の要素が影響している可能性が示唆された。
また、SARS-CoV-2 RNA 5’UTRに存在するSL構造のうち、SL1、SL2、SL3、SL5を標的部位とするsiRNAに、武漢株から最近のオミクロン株に至るまで全てのSARS-CoV-2変異体に対して、ウイルス増殖を1/10以下に抑制する効果が認められた。これらの標的領域はSARS-CoVを含めたサルベコウイルス属でも保存されていることから、今後出現しうる変異体にも有効であることが期待される。SLのように高次構造を取りやすい領域を標的としたことで、ウイルス増殖におけるそのRNA構造の重要性についても検討可能である。さらに、その標的領域に作用するシード配列を持つマイクロRNAの中には、肺で発現し、細胞増殖などに関わる機能を持つものがあった。これは、SARS-CoV-2感染時にマイクロRNAがウイルスゲノムに吸着することにより宿主細胞内で枯渇し、遺伝子発現パターンが変わることで病原性に影響している可能性も考えられる。
以上のように、SARS-CoV-2ゲノムを標的としうる候補マイクロRNAが探索できただけではなく、それらの作用メカニズムや感染細胞での遺伝子発現に与える影響について、新たな知見の獲得が期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度得られた候補マイクロRNAを培養細胞に強制発現し、同じ領域を標的とするsiRNAとの比較を行うとともに、SARS-CoVおよびSARS-CoV-2に対する増殖阻害効果を検討する。
また、siRNAおよびマイクロRNA存在下でウイルスを継代して耐性変異体の出現の有無を検討し、可能であればマウス馴化SARS-CoV-2を用いたマウス感染モデルを用いてin vivoでの治療効果を見る。
さらに、SL構造のように高次構造を取りやすい領域を標的とすることで、RNAサイレンシングのみならずその構造形成阻害を通してウイルス複製・増殖阻害を行なっている可能性もあるため、RNAよりも強い結合親和性を持つLNAを用いた一本鎖アンチセンス核酸を用いてそのRNAの構造の重要性についても検討する。
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