Development of inhibitors for dimerization of N-protein using SARS-CoV-2 replicon system

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K07044
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 池田 正徳 鹿児島大学, 医歯学域ヒトレトロウイルス学系, 教授 (30315767)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: SARS-CoV-2 / Nタンパク質 / スプリットルシフェラーゼ

Outline of Annual Research Achievements

申請者はC型肝炎ウイルス(HCV)の研究から、ウイルスの複製と粒子形成のいずれにも重要な役割を果たすNS5Aとその阻害剤に着目しSARS-CoV-2の治療剤開発でも同様の治療剤開発ができないかと考え本研究を立案した。NS5Aタンパク質はhomodimerを形成し、homodimerの形成を阻害するNS5A阻害剤がc型慢性肝炎の「治療剤の中心となっている。SARS-CoV-2のNタンパク質は複製と粒子形成に必要なことが知られている。Nタンパク質もhomodimerを形成することが知られているためdimer形成を阻害する化合物のタンパク質の同定するためのスプリットルシフェラーゼ法による評価系を本研究期間中に開発した。レニラルシフェラーゼを２つのドメイン（ラージドメイン及びスモールドメイン）にわけて、それぞれをNタンパク質に融合させ、dimer形成が発行するスプリットルシフェラーゼ評価系を開発した。2種類のプラスミドを細胞に導入し、基質を加えることで発光を確認できた。現在、いくつかの細胞 (HuH-7細胞株およびそのクローン化細胞株、HEK293細胞株、Hela細胞株等）を用いて最も高いルシフェラーゼ活性を示す条件を検討している。FDA承認薬ライブラリー等を用いて10μMで処理したときに細胞毒性が10%以下で50%以上抑制することを有効性の基準とした。これまでに、dimer形成を阻害する化合物は得られていないが引き続きスクリーニングを実施する。