2021 Fiscal Year Research-status Report
Understanding the role and regulation of human cytomegalovirus UL97 kinase
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21K07046
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
岩堀 聡子 藤田医科大学, 医学部, 講師 (80416164)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ヒトサイトメガロウイルス / UL97キナーゼ / リン酸化 / 基質 / DNAJA1 / 活性制御 / NONO |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)感染は宿主の免疫状態により日和見感染症をきたし、また先天性HCMV感染症の原因となる。ワクチンはなく、現行薬ガンシクロビルには耐性ウイルスの出現や副作用の問題があり、新規抗HCMV薬が求められる。
ヒトサイトメガロウイルスUL97キナーゼ（HCMV-UL97）は宿主cyclin-dependent kinase(CDK)の機能ホモログであり、ウイルスCDKとも呼ぶ。UL97は抗ウイルス薬ガンシクロビルをリン酸化することに加えて、2021年に米国で承認されたマリバビルの標的であるなどHCMV感染制御において重要な因子である。これまでにUL97の相互作用因子を網羅的に解析し、49の候補因子を得た。令和３年度は、そのうち30因子について発現ベクターを作製し、(1)新規基質の同定、(2)キナーゼ活性制御因子の同定を試みた。
(1)UL97と上記30因子を共発現した細胞溶解液をリン酸基捕捉分子であるPhos-tagを用いたSDS-PAGEによりリン酸化をバンドシフトとして検出した。その結果、UL97の新規基質としてDNAJA1（HSP40相同体）を同定した。HCMV感染における同因子のリン酸化も確認した。また、非リン酸化アミノ酸アラニンへの置換変異を行い、２つのリン酸化部位を明らかにした。
(2) RB不活化アッセイ（Saos-2細胞にてUL97とRBを共発現し、E2F依存的転写に伴うルシフェラーゼ量を測定）によって上記30因子を評価したところ、NONO(Non-POU domain-containing octamer-binding protein)との共発現によりE2F依存的転写活性の上昇を観察した。この活性上昇はUL97との共存下に特異的であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和３年度は、UL97の新規基質（DNAJA1）とUL97の活性制御に関与する因子（NONO）をそれぞれ同定することができた。予備実験においてDNAJA1を含むHSP40に対する阻害剤を用いたところ、HCMVの増殖が顕著に減弱することがわかった。DNAJA1のノックアウト細胞を作製済みであり、DNAJA1のウイルス増殖における重要性を検討するのに用いる。同様にRB不活化アッセイにおいてNONOの不在が及ぼす影響を調べるためにNONOノックアウトSaos-2細胞を作製済みである。
HCMVは広い細胞種(fibroblast, endothelial, epithelial, smooth muscle cells, macrophage)で増殖可能であり、HCMV研究に汎用されるfibroblast以外の細胞も用いることで新たな知見が得られる可能性がある。但し、他の細胞ではfibroblastよりも感染効率が低い。そこで令和３年度はEpithelial RPE-1A細胞において、感染条件の検討を行い、遠心法により感染効率が上がることを見出した（centrifugal enhancement）。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画調書に示した研究計画、方法の通りに行う。UL97の新規基質（DNAJA1）と活性制御に関与する因子（NONO）がどのようにHCMV感染に関与するのかを明らかにする。
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