ウイルス感染を制御する宿主の新規抗ウイルス因子の同定

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07048
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 中津 祐一郎 国立感染症研究所, ウイルス第三部, 主任研究官 (70572113)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 抗ウイルス応答

Outline of Annual Research Achievements

ウイルス感染を制御する宿主の新規抗ウイルス因子を同定することを目標とし、CRISPR-dCAS9遺伝子発現活性化型ライブラリーと風疹ウイルスを用いたスクリーニングを計画している。令和3年度は、この解析を行う上の課題である、(1)インターフェロン（IFN）非応答性の風疹ウイルス高感受性培養細胞の作出および、(2)細胞障害性の高い組換え風疹ウイルスの作製を実施した。
(1)については、ヒト肺がん由来培養細胞株A549細胞をベースにCRISPR-Cas9法によるゲノム編集を行い、ウイルス感染時のIFN誘導に必須の宿主因子であるIPS-1を欠損した風疹ウイルス高感受性細胞A549/IPS-1-KOを作製した。しかしながらこの細胞では、遺伝子発現活性化型ライブラリーの中に各種IFN遺伝子の発現を活性化するガイドRNA（gRNA）が存在することでIPS-1非依存的にIFNが発現し、各細胞に導入された個別のgRNAとは無関係に細胞集団全体に風疹ウイルス抵抗性が付与される。この問題を解決するため、さらに1型および3型IFNのレセプター分子であるIFNAR1およびIFNLR1を欠損させた培養細胞A549/IPS-1,IFNAR1,IFNLR1-TKO細胞を作製した。この細胞が上記のスクリーニングに適した細胞であることを確認するため、組換えIFNの存在化で風疹ウイルスの増殖が低下しないことを確認した。
(2)の目標を達成するため、自殺遺伝子である単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-TK）を導入した組換え風疹ウイルスrRV-HSVTKを作製した。この組換えウイルスを上記のA549/IPS-1,IFNAR1,IFNLR1-TKO細胞に感染させた後、HSV-TKが細胞死を誘導するために必要なガンシクロビル（GCV）を培養液に添加したところ、1週間程度でほぼ全ての細胞が死滅することを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和３年度に予定していた、CRISPR-dCAS9による遺伝子発現活性化型ライブラリーと風疹ウイルスを用いたスクリーニングの準備段階については、概ね順調に進めることができた。IFN非応答性の風疹ウイルス高感受性培養細胞と、高細胞障害性の組換え風疹ウイルスの作製とその評価が完了した。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度に作製した、IFN非応答性で風疹ウイルス高感受性細胞であるA549/IPS-1,IFNAR1,IFNLR1-TKO細胞に、CRISPR-dCAS9遺伝子発現活性化型ライブラリーを導入する。作製できた細胞群に、既に作製済みのGCV誘導性高細胞障害性の組換え風疹ウイルスであるrRV-HSVTKを感染させ、GCV処理後に生き残る風疹ウイルス抵抗性細胞を選択する。回収した細胞からゲノムDNAを回収し、次世代シークエンスにより新規抗風疹ウイルス因子候補を同定する。これまでに既に確立済みのゲノム編集法を用いて再度、各候補遺伝子のKO細胞の作製を行い、表現系を確認することで、新規抗ウイルス因子の確認実験を行う。

Causes of Carryover

（理由）現在までに完了している実験が当初の想定より効率よく実施出来たため、次年度使用額が生じた。
（使用計画）令和4年度に予定している解析には、スクリーニングや次世代シークエンスなど比較的費用が多く必要なものがあるので、それらに使用する。