2021 Fiscal Year Research-status Report

インフルエンザウイルス分節化ゲノムの自己組織化に不可欠な塩基配列の決定とその応用

Research Project

Project/Area Number	21K07056
Research Institution	National Institute of Infectious Diseases
Principal Investigator	百瀬文隆国立感染症研究所, 感染症危機管理研究センター, 主任研究官 (90332204)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	RNA-RNA相互作用 / RNA二次構造 / ワクチン開発 / リアソータント / リバースジェネティクス / 遺伝子再集合 / リボヌクレオプロテイン複合体 / RNP
Outline of Annual Research Achievements	インフルエンザウイルスの８分節化したRNAゲノム(vRNA)が子孫ウイルス粒子へどのようにして選択的にパッケージングされるのか詳細なメカニズムは不明であるが、異なる分節間の特異的な塩基対形成によると考えられている。本研究の目的は、この選択的分節集合に必須の塩基配列、すなわち全分節のパッケージングシグナル(PS)を１塩基解像度で決定することである。本年度は第6分節3'末端に着目した。PS領域と考えられる16～70塩基の範囲を4領域(A、B、C、D）に区分し、各領域の全塩基を相補塩基に置換した変異ウイルスを逆遺伝学的手法により作製した。その結果、領域B～Dについては相補変異ウイルスの増殖不良はみられなかったが、領域Aに相補置換を導入すると変異ウイルスの増殖が顕著に阻害されることが判明した。次に、各領域をランダムに相補塩基へ置換し2塩基混合配列とした変異ウイルスライブラリを作製した。増殖可能な変異ウイルスを選別しダイレクトシークエンス法により塩基混合状態の確認を行った。その結果、選択圧がかからなければ野生型塩基比率50%が見込まれるところ、領域Aの6箇所で野生型塩基が70%以上まで選択されていた。領域B～Dについては、特定の塩基が選択されることはなかった。領域Aの機能を探るため第6分節vRNA末端の二次構造を予測したところ、増殖に必須であった野生型塩基はRNA分子内の二本鎖形成にかかわる可能性が高い塩基であった。塩基対の一方が相補塩基に置換され二次構造が破壊されるとウイルス増殖に必須の素過程が阻害されるため、変異が許容されなかった可能性が考えられる。ただし当該領域が他分節と塩基対形成する可能性もまだ残されているため、今後は実験系の改良およびこれらの塩基が選択的分節集合に寄与するかの解析を進める。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 研究代表者が令和３年度途中に所属機関を変更したため、実験計画の一部遅延がみられる。新所属機関の部署新設に伴う異動であり、実験室の新設（機器・試薬等の設置や調達、遺伝子組換え実験を行うために必要な所属機関内および法令上の手続き）に数ヶ月の時間を必要とした。ただし現所属機関で解析手法の改善目途が立ったため、今後はより確実性の高い手法を用いて実験をすすめることが可能と考えている。例えば、次世代シークエンサーによる単分子核酸の配列解析を計画に組み入れることで、復帰変異株の全ゲノム解析による分節間塩基対形成の全体像が推定可能になると考えている。
Strategy for Future Research Activity	令和4年度は、上記の次世代シークエンサーを用いた解析に加え、デジタルPCRの導入により分節コピー数を正確に測定しパッケージング異常の高精度検出をめざす。法令上の手続きが完了し遺伝子組換えウイルスが使用可能になり次第、前年度までと同様の解析も再開する。令和5年度は、令和4年度までに得られた情報を基にして、分節間の塩基対形成を一次配列から推測し、8分節vRNP超複合体の安定性を数値評価可能なモデルの構築を目指す。
Causes of Carryover	令和３年度途中に研究代表者の所属機関変更があり、実験室の新設と実験開始に必要な所属機関内および法令上の手続きに想定以上の時間がかかってしまったため実験計画の一時中断があった。年度末に物品等の調達が可能となったが、発注～支払い期日の都合上あらためて令和４年度より使用することとした。