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2021 Fiscal Year Research-status Report

Identification of host factors interacting with acetylated influenza A virus

Research Project

Project/Area Number 21K07058
Research InstitutionTokushima Bunri University

Principal Investigator

畠山 大  徳島文理大学, 薬学部, 准教授 (20514821)

Project Period (FY) 2021-04-01 – 2024-03-31
Keywordsインフルエンザウイルス / NP / アセチル化修飾 / インタラクトーム解析
Outline of Annual Research Achievements

本研究は,インフルエンザウイルスのNPに対するアセチル化修飾の生物学的意義を解明することを目的とし,アセチル化されたNPとの相互作用因子を網羅的に解析するものである.手法としては,NPの組換えタンパク質を用いて実験を行う予定だが,本研究室で従来行ってきた大腸菌で組換えタンパク質を作製する方法では,発現させている過程で,どうしてもNPがアセチル化修飾を受けてしまうことが分かっている.そこで,無細胞系組換えタンパク質合成キットであるPUREflexで合成を行うことにした.これまでの研究では,インフルエンザウイルスNPの発現プラスミドへのクローニングを完了した.そして,抗NP抗体および抗Strep-tag抗体を用いたウェスタンブロッティングにより,PUREflexによる発現にも成功したことを確認した.しかし,抗アセチル化リジン抗体を用いた解析を行ったところ,アセチル化酵素と反応させていないにも関わらず,シグナルが確認されてしまった.PUREflexには,アセチル化酵素の類は一切含まれていないことから,抗体の非特異的結合であると考えられるが,現時点では確証はない.そこで,質量分析などで,アセチル化修飾の有無を正確に解析することを視野に入れている.
また,インフルエンザウイルスPAのアセチル化修飾に関する論文を発表することができた.宿主側のアセチル化酵素が,PAの19番目のリジン(K19)をアセチル化し,それによってPAエンドヌクレアーゼ活性が増強された。宿主のアセチル化酵素を使ってPAのK19をアセチル化させ,PAエンドヌクレアーゼ活性を増強し,より効率よくウイルスmRNAを合成させているのではないか,という新規な「宿主と病原体との攻防」であると考えられる.加えて,新型コロナウイルスのNタンパク質も,試験管内においてアセチル化を受けることも報告した.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

概ね順調に進展していると考えている.本研究は,「アセチル化されたタンパク質と相互作用する因子の同定」という,前例のない研究課題に挑戦するものであるが,現時点で発現プラスミドの構築と目的タンパク質の発現まで順調に推移している.

Strategy for Future Research Activity

現時点での課題は,無細胞系組換えタンパク質合成キットPUREflexで作成したインフルエンザウイルスNPが,既にアセチル化されていないかどうかの確認が不十分である,という点である.確認方法として,現状では抗アセチル化リジン抗体を用いたウェスタンブロッティングを行ったが,シグナルが検出された.PUREflexの溶液にはアセチル化酵素もアセチルCoAも含まれていないので,アセチル化されているとは考えにくく,抗アセチル化リジン抗体の非特異的結合と考えられる.そこで,質量分析により,アセチル化の有無を詳細に確認する.アセチル化されていないことが確認できた後は,Strep-Tactinが付加されたビーズでタンパク質を捉え,アセチル化酵素とアセチルCoAを混合し,アセチル化を施す.これに,細胞のライセートを加え,アセチル化修飾依存的な相互作用因子のスクリーニングを目指す.

Causes of Carryover

海外にしか在庫がなかった試薬およびキットが,新型コロナウイルス蔓延により直ぐに輸入することができず,年度内に入手できなかったため.

  • Research Products

    (8 results)

All 2022 2021

All Journal Article (6 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 5 results) Presentation (2 results)

  • [Journal Article] Acetylation of the influenza A virus polymerase subunit PA in the N‐terminal domain positively regulates its endonuclease activity2022

    • Author(s)
      Hatakeyama Dai、Shoji Masaki、Ogata Seiryo、Masuda Takeshi、Nakano Masahiro、Komatsu Tsugunori、Saitoh Ayaka、Makiyama Kyoko、Tsuneishi Hazuki、Miyatake Asuka、Takahira Mizuki、Nishikawa Erina、Ohkubo Ayana、Noda Takeshi、Kawaoka Yoshihiro、Ohtsuki Sumio、Kuzuhara Takashi
    • Journal Title

      The FEBS Journal

      Volume: 289 Pages: 231~245

    • DOI

      10.1111/febs.16123

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression2022

    • Author(s)
      Noguri Taisei、Hatakeyama Dai、Kitahashi Takashi、Oka Kotaro、Ito Etsuro
    • Journal Title

      Molecular Brain

      Volume: 15 Pages: 44

    • DOI

      10.1186/s13041-022-00927-6

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] CNS serotonin content mediating food deprivation-enhanced learning is regulated by hemolymph tryptophan concentration and autophagic flux in the pond snail2022

    • Author(s)
      Totani Yuki、Nakai Junko、Hatakeyama Dai、Dyakonova Varvara E.、Lukowiak Ken、Ito Etsuro
    • Journal Title

      Nutritional Neuroscience

      Volume: - Pages: 1~11

    • DOI

      10.1080/1028415X.2022.2033045

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Insulin and Memory in Invertebrates2022

    • Author(s)
      Nakai Junko、Chikamoto Nozomi、Fujimoto Kanta、Totani Yuki、Hatakeyama Dai、Dyakonova Varvara E.、Ito Etsuro
    • Journal Title

      Frontiers in Behavioral Neuroscience

      Volume: 16 Pages: -

    • DOI

      10.3389/fnbeh.2022.882932

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] In-vitro acetylation of SARS-CoV and SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins by human PCAF and GCN52021

    • Author(s)
      Hatakeyama Dai、Masuda Takeshi、Miki Ryosuke、Ohtsuki Sumio、Kuzuhara Takashi
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 557 Pages: 273~279

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2021.03.173

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Histone acetyltransferase activity of CREB-binding protein is essential for synaptic plasticity in <i>Lymnaea</i>2021

    • Author(s)
      Hatakeyama Dai、Sunada Hiroshi、Totani Yuki、Watanabe Takayuki、Fellet?r Ildik?、Fitchett Adam、Eravci Murat、Anagnostopoulou Aikaterini、Miki Ryosuke、Kuzuhara Takashi、Kemenes Ildik?、Ito Etsuro、Kemenes Gy?rgy
    • Journal Title

      bioRxiv

      Volume: - Pages: -

    • DOI

      10.1101/2021.05.26.445902

    • Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] 新型コロナウイルスSARS-CoV-2のNタンパク質に対するアセチル化修飾2022

    • Author(s)
      三木 涼輔,畠山 大,増田 豪,村本裕紀子,野田 岳志,大槻 純男,葛原 隆
    • Organizer
      日本薬学会 第142年会
  • [Presentation] 新型コロナウイルスNタンパク質におけるアセチル化修飾2021

    • Author(s)
      畠山 大,増田 豪,三木 涼輔,大槻 純男,葛原 隆
    • Organizer
      第34回インフルエンザ研究者交流の会シンポジウム

URL: 

Published: 2022-12-28  

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