2022 Fiscal Year Annual Research Report
Vasohibin-2による横紋筋肉腫の悪性化制御機構の解明と新規治療法の開発
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21K07089
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
鈴木 康弘 東北大学, 未来科学技術共同研究センター, 特任助教 (60332277)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | vasohibin / VASH2 / SVBP / 微小管 / がん悪性化 / 脱チロシン化 / チューブリン / 液ー液相分離 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
バキュロウイルスによる蛋白発現系でGFPを付与したVASH2-SVBP複合体とVASH1-SVBP複合体および各種VASH変異体-SVBP複合体蛋白の合成と精製を行い、ポリエチレングリコールを含有するバッファー内における液-液相分離現象を確認したところ、VASHのα-チューブリン脱チロシン化活性を欠損する変異体とVASHのN末端とC末端にある天然変性（disorder）領域を双方とも欠損する変異体においても野生型VASHと同様に液-液相分離を誘導することを確認した。また、VASHのN末側order領域の一部を欠損することによって、VASH-SVBP複合体形成に明確な影響は認められないが、蛋白安定性が減弱する傾向が確認された。NanoLucルシフェラーゼ断片と高い親和性のあるHiBiTタグをC末端に付与した各種VASH2変異体とSVBPを細胞に強制発現させ、細胞が合成するVASH2-SVBP複合体の細胞内蛋白量と培養液中の細胞外分泌量をルシフェラーゼ活性で測定したところ、SVBPとの複合体形成に必要とされるVASH2側のアミノ酸配列に変異を加えることで、野生型と比して変異VASH2の細胞内蛋白量と細胞外分泌量が連動して減少することを確認した。精製VASH2-SVBP 複合体は細胞外刺激性に培養血管内皮細胞の機能に明確な影響を与えなかった。VASH2 mRNAのExon7を標的とするアンチセンスオリゴをヒト胞巣型横紋筋肉腫細胞株に導入することによって、細胞内のVASH2蛋白量が減少し、これに伴いα-チューブリンの脱チロシン化レベルが抑制されることを確認した。
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