2021 Fiscal Year Research-status Report
Cross-talk between cancer cells and fibroblasts during cancer progression.
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21K07118
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
滝野 隆久 金沢大学, GS教育系, 教授 (40322119)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | がん細胞 / 線維芽細胞 / 細胞外マトリックス / マトリックスメタロプロテアーゼ / 微小環境 / 浸潤 / 細胞運動 / インテグリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん組織におけるがん細胞の階層性とがん微小環境の不均一性が、がん治療の大きな障壁となっている。がん微小環境は、がん細胞や線維芽細胞等の細胞性成分と細胞外マトリックス (ECM)から構成されており、がん幹細胞維持、がん浸潤・転移や薬剤耐性等のがん悪性化進展に寄与している。がん組織におけるECM改編は、がん微小環境の不均一性の中核であり、がん細胞のECM分解酵素であるMT1-MMPによるECM分解誘導がその引金となる。がんECM構築に中心的な役割を果たしているのは、がん細胞により教育されたがん関連線維芽細胞である。本研究では、TGF-betaを中心としたがん細胞-線維芽細胞-がんECM間の相互教育プログラムを解明し、がん治療効果の増強が期待されるがん微小環境の正常化療法の開発を試みる。
我々は、上下二層のコラーゲンゲル間の細胞移動を測定する細胞浸潤測定法（iCT法）を開発した。この方法を用いてがん細胞浸潤を増強する線維芽細胞との共培養法を本年度に確立した。まず、下層のゲル中のMT1-MMPを発現しているがん細胞が、線維芽細胞を含む上層のゲルへ浸潤する様式を検討した。上層のゲル内で水平に配列している線維芽細胞が、方向性を変えて垂直に整列している部分に下層ゲルのがん細胞が浸潤していることがわかった。線維芽細胞を直径200nmの細胞接着性ビーズに試験管内で接着させた後、ビーズをコラーゲンゲル内で培養すると、線維芽細胞が放射状に遊走・伸展していた。線維芽細胞を接着させたビーズを上層ゲル内に包埋することで垂直方向に配列した線維芽細胞数が増加し、その結果、下層ゲル内の多数のがん細胞が上層ゲル内へ浸潤することが判明した。この条件下でTGF-betaを添加すると、MMP-9の発現亢進とMMP-2の活性化が誘導され、上層ゲル内に浸潤するがん細胞が顕著に増加した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
がん細胞と線維芽細胞間の相互教育プログラムを理解するため、がん細胞浸潤を効率的に誘導する微小環境の再構築を試みた。がん細胞浸潤は、申請者が開発した上下二層のゲル間の細胞の垂直移動を測定する細胞浸潤測定法（iCT法）を用いて評価した。下層のコラーゲンゲルにMT1-MMP発現がん細胞を包埋し、上層コラーゲンゲルへの細胞移動を測定した。がん細胞のTGF-beta処理はMMP-9の発現と分泌を亢進し、培地中に添加したMMP-2はがん細胞のMT1-MMPにより活性化された。培地中にTGF-betaとMMP-2の両方を添加するとMT1-MMPにより活性化されたMMP-2がTGF-betaにより誘導されたMMP-9を活性化し、下層コラーゲンゲルの収縮をともなって上層コラーゲンゲルへのがん細胞浸潤が顕著に増強された。次にMMP-2とTGF-betaの供給源として上層コラーゲンゲルにヒト肺線維芽細胞を包埋し、下層ゲル中のがん細胞の上層ゲルへの移動を検討した。線維芽細胞由来のMMP-2の活性化は認められたが、MMP-9の発現は亢進しなかった。また、共培養した線維芽細胞によるがん細胞浸潤の誘導は軽微なものであった。大部分の線維芽細胞は上層ゲル内で水平方向に伸展していたが、がん細胞が浸潤している領域では、がん細胞と線維芽細胞はともに垂直方向に伸展・並走している状況が観察された。
細胞接着性ビーズに線維芽細胞を接着させてコラーゲンゲルで培養すると、細胞はビーズから放射状に遊走・伸展した。線維芽細胞が接着したビーズを上層ゲルに、がん細胞を下層ゲルに包埋して共培養することでがん細胞の上層ゲル内への浸潤が増強された。TGF-betaの添加は、MMP-9発現亢進、MMP-2活性化をともなってがん細胞浸潤を顕著に増加した。がん細胞と線維芽細胞の位置情報が、がん細胞の遊走に重要であることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
がん微小環境では、線維芽細胞由来のMMP-2をがん細胞のMT1-MMPが活性化し、がん細胞が産生するMMP-9を活性型MMP-2が活性化する。この結果、ECM分解酵素の活性化連鎖反応が誘発されてECM破壊が進行する。がん細胞や線維芽細胞のインテグリン等の細胞膜分子やTGF-beta等の生理活性物質の活性制御は、ECMとECM分解酵素相互依存的に行われており、がん細胞と線維芽細胞間の相互教育プログラムは継続され、がん微小環境が整備されていると推測される。
本研究により、MT1-MMPを発現するがん細胞層に対して線維芽細胞が直角に配置された場合、がん細胞のコラーゲンゲル中の細胞移動が誘導されることが判明した。TGF-betaの添加はMMP-9発現とMMP-2活性化を誘導するとともに、線維芽細胞との共培養により誘導されるがん細胞浸潤を顕著に亢進した。このTGF-betaにより亢進された細胞浸潤は、MT1-MMPの発現抑制やMMP阻害剤を加えることにより抑制された。
TGF-betaシグナルはがん関連線維芽細胞の前駆細胞の形質転換に重要であり、高転移性がん細胞にはTGF-bateシグナル経路に混乱を生じる遺伝子変異とエピゲノム変化が必要である。がん細胞と線維芽細胞のシグナル伝達経路、遺伝子発現プロファイル、プロオテオーム等のin vitro解析を駆使してMMP-9活性化因子の同定とその制御機構の解明、細胞のがん関連線維芽細胞化に関わる因子の同定を試みる。また、金沢大学がん進展制御研究所機能ゲノミクス研究分野（鈴木健之教授）で作成されたエピジェネティクスに関連する遺伝子発現抑制ライブラリーをがん細胞に導入し、この現象を正負に制御するエピジェネティク因子の同定も試みる。以上の結果を踏まえて、がん微小環境を正常化へと導く方法の開発を目指す。
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