2021 Fiscal Year Research-status Report
A novel function of LATS kinases in cancer progression via liquid-liquid phase separation
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21K07122
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藪田 紀一 大阪大学, 微生物病研究所, 准教授 (10343245)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | がん悪性化 / 液-液相分離 / LATS / キナーゼ / Hippo経路 / 核小体 / DNA損傷 / リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高分子の相分離凝集で起こる液-液相分離（LLPS）現象は、中心体や核小体などを含む非膜性細胞内小器官の形成と維持やヘテロクロマチンの形成などに重要な役割を担っており、LLPSの異常ががんを含む複数の疾病発症に関連することからその重要性が注目されている。特に最近、我々はLATS2キナーゼのリン酸化標的として核小体構成因子PHF6を新たに同定したので、本研究ではLATS1/2あるいはPHF6などのリン酸化標的因子群が中心体や核小体を含む非膜性細胞内小器官に集積するメカニズムとLLPSの関係を明らかにし、がん悪性化におけるLLPSの新たな機能を解明することを目指す。本年度はほぼ計画どおり順調に実験が進み以下の研究成果を得た。[1] LATS1/2とLLPSの関係を明らかにするために、LATS2の全長あるいは断片化した部分欠失変異体を蛍光タンパク質GFPとの融合タンパク質として大腸菌で発現させて精製する実験系を構築した。これにより精製したGFP-LATS2タンパク質がin vitroでドロップレット（液滴化）現象を起こすかを検証中である。[2] 最近我々は、LATS2によるPHF6のリン酸化部位を決定したので、これに対する抗リン酸化抗体を用いて子宮頸がん細胞株HeLaの蛍光免疫染色を行ったところ、リン酸化型PHF6はUV照射に依存して核スペックルに局在し、このリン酸化シグナルはLATS1/2阻害剤あるいはLLPS阻害剤で処理することにより減衰あるいは消失した。これらの結果は、DNA損傷に応答したLATS1/2がPHF6をリン酸化することでPHF6の細胞内局在を変化させてその機能やLLPS現象に影響を与えている可能性を示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Hippo経路の中核キナーゼであるLATS2がUV照射におけるDNA損傷に応答して核小体タンパク質PHF6の特定のアミノ酸残基をリン酸化することでその細胞内局在を変化させることを明らかにした。我々がゲノム編集技術により作製したLATS2ノックアウトHeLa細胞（LATS2 KO-HeLa）や最近市販されたLATS1/2のキナーゼ阻害剤を用いることでPHF6のリン酸化制御がLATS2に特異的であることも確認した。また、リン酸化型PHF6が核内の非膜系構造体のひとつである核スペックルに集積することを見出したがLLPS阻害剤によりこのリン酸化シグナルが消失したことから、この集積がLLPS現象によるものであることが示唆された。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も研究計画どおり推進する。がん悪性化におけるLLPSの新たな機能を解明するために、LATS1/2キナーゼあるいはそのリン酸化標的因子群（PHF6など）が中心体や核小体を含む非膜性細胞内小器官に集積する分子メカニズムとLLPSの関係を引き続き調べていく。LATS2のリコンビナントタンパク質を用いたin vitroにおけるドロップレット（液滴化）現象の有無についても条件検討などを含めて予定通り進めていく。また、液滴内部でポリマー構造を形成しているのであれば、そのポリマー構造はLATS1/2のN末領域がリン酸化されることにより崩壊するのか、あるいは液滴自体の融解を導くのかを検証していく。さらに、がん幹細胞におけるLATS1/2の役割に関しても引き続き実験を進めていく。
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| Causes of Carryover |
今年度は、大きな実験の失敗なども無く、当初の計画以上に実験を順調に進めることができた。実験の失敗などが少なかった分、無駄が少なかったため予定していたよりも支出を抑えることができたが、論文投稿に向けた追加実験や論文投稿後のリバイズで大量の実験を要求されることが今後予想されることから次年度も計画どおり実験を推進するために次年度使用額が生じた。
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Research Products
(1 results)
