2021 Fiscal Year Research-status Report
Basic research on the development of new therapeutic methods for cancer metastasis targeting the CDCP1 extracellular domain
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21K07165
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| Research Institution | 防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群) |
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Principal Investigator |
上北 尚正 防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群), 応用科学群, 准教授 (50373402)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 癌転移 / 足場非依存性能 / CDCP1 / セリンプロテアーゼ / MT-SP1 / 複合体形成 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、まず最初に臨床的にCDCP1及びMTSP-1の発現が重要であるかを検証するために、CDCP1のmRNA発現とセリンプロテアーゼMT-SP1のmRNA発現と生命予後との関連を検証した。肺癌や膵臓癌、乳癌等でCDCP1とMT-SP1はmRNA高発現で予後不良であることが明らかとなった。胃癌に関しては、CDCP1は高発現でMT-SP1は低発現で予後不良となったが、CDCP1が足場非依存性能に関与するのはスキルス胃癌であり、その情報は今回のデータベースにはなかったため、スキルス胃癌のデータを探して詳細を検討する予定である。
また、MT-SP1を介したCDCP1切断と足場非依存性能との関連性について検証したところ、CDCP依存的な足場非依存性能を持つ癌細胞株においてCDCP1切断が多いことが確認できたこと事から、MT-SP1によるCDCP1切断が足場非依存性能の獲得に関与する可能性を示唆する結果を得た。その一方で、MT-SP1がないいくつかの癌細胞株でCDCP１切断が確認できた事から、MT-SP1非依存的な機能もあるとみて、後に研究をすることとした。
さらに、CDCP1の多量体形成に関するMT-SP1の関与について、標識付の各種CDCP1変異体を用いた免疫沈降実験から、CDCP1のCUB1ドメインのよりN末端側220アミノ酸を欠失した変異体は、CDCP1の同種多量体形成を促進する可能性が明らかとなった。これは、MT-SP1で切断される領域よりもN末端側にあり、切断後に遊離される領域であることから、N末端側の220アミノ酸が多量体形成の制御に関与しうる可能性を見出した。
今後は、CDCP1切断をMT-SP1が直接的におこなっているかをMT-SP1の強発現や抑制によって検討していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨今の状況により、必要な試薬等の入手に遅延が出ており、実験計画に遅れがでている。
例としては、MT-SP1のsiRNAのRNA配列の設計において抑制条件が最適ではなく、検討を進めるために再注文するが、当初の予定よりも納入に少し遅れが出てしまっていること等が挙げられる。また、本研究で得られた結果から、さらに必要とされる新規のMT-SP1およびCDCP1の変異体の作成にも遅れが生じている。
これらを総合的に評価して「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
癌細胞に対するMT-SP1の発現および抑制をおこなうため、MT-SP1発現ベクターやMT-SP1 siRNAの遺伝子導入に対する最適条件や癌細胞株の選定をおこなう。その後、CDCP1切断にMT-SP1が直接的に関与しているかを明らかにする。CDCP1とMT-SP1の結合に関しても免疫沈降等で検証する。
また、CDCP1の切断されている癌細胞にはMT-SP1 siRNAを、CDCP1切断のない癌細胞にはMT-SP1を強発現させ、CDCP1の多量体形成及びCDCP1下流シグナルへの関与等について抗体を用いた免疫沈降とウエスタンブロットにより検証をおこなう。
さらに、MT-SP1の有無に寄るCDCP1切断を検証した癌細胞が足場非依存性能に関与しているかをSoft agar assayや細胞死検定等により検証することでMT-SP1の切断が足場非依存性能に関与しているかを明らかにする。
それ以外に、細胞外のCUBドメインを用いたカラムを作製しCUBドメインに結合する他のタンパク質の同定をおこない、CDCPとMT-SP1を含むCDCP1細胞外領域を介した複合体について検証を進めていく。
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| Causes of Carryover |
研究に必要とする試薬の検定と研究試薬等（siRNA, DNAプライマー, 細胞培養関連試薬等）の納期の遅れ等により、次年度使用額が生じた。
siRNA等の設計やDNAプライマーを用いた各種変異体の細胞発現ベクターの作成および細胞培養試薬等による実験に使用する。
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