2021 Fiscal Year Research-status Report

ユビキチン化の検出システムの開発と担癌マウスモデルでの検証

Research Project

Project/Area Number	21K07197
Research Institution	Tokyo University of Science, Yamaguchi
Principal Investigator	宮本和英山陽小野田市立山口東京理科大学, 薬学部, 教授 (10415317)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	ユビキチン化
Outline of Annual Research Achievements	生体内でのタンパク質の品質管理機能を担うユビキチン化は、白血病など様々な疾患との関係が深く、ユビキチン化の度合いを高感度に検出できれば将来的に疾患の診断・病態把握が可能である。これまでにユビキチン化に関わる酵素であるユビキチンリガーゼ(E3)を独自の技術で人工的に作製してきた。既に人工E3 を活用してユビキチン化の度合いを検出測定することに成功している。本申請研究では、ユビキチン化を高精度・定量的に計測できる検出システムの構築に向けて、蛍光偏光法を活用したユビキチン化の度合いの検出を検討する。今年度では、これまで開発してきた分子設計技術に基づき(特許第5971788号)、急性前骨髄性白血病（APL）に関与するSIAH-1活性部位を移植した人工E3の合成を行った。合成はFmoc固相法で行い、グラジエントHPLCにて精製した。透析操作を経て人工E3をフォールドさせ、その活性確認は単離精製したE1、E2、ユビキチンとともに混合させてユビキチン化を生じさせ、ウエスタンブロット法で実施した。次に、各種濃度の異なるE2を含有するサンプルを用意し、蛍光標識した人工E3のユビキチン化の度合いを、蛍光偏光法（分光蛍光光度計 F-7100, 日立製）で、ユビキチン化によって生じる分子サイズの増加に伴う分子運動の変化の観点から測定を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の研究計画通りに概ね進行している
Strategy for Future Research Activity	今年度の研究を通して、蛍光標識した人工E3とE2との相互作用によって、その蛍光強度が増強されることが新たに判明した。これを利用して、人工E3とE2との相互作用の強度(Kd)を算出をする。E2の種類を様々に変化させて、Kdの違いを明らかにし比較検討して、人工E3の特性を評価していく。一方、当初の予定通り、急性前骨髄性白血病細胞株ＮＢ４に抗癌剤ボルテゾミブを作用させ、その培養上清中でのユビキチン化の度合いの検出・測定を実施する予定である。
Causes of Carryover	残金2115円については、試薬の購入代として次年度に使用する。