2023 Fiscal Year Research-status Report
免疫チェックポイント阻害剤応答性細胞集団に発現する新規機能分子の解析
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21K07199
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| Research Institution | International University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
大多 茂樹 国際医療福祉大学, 医学部, 准教授 (20365406)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三沢 彩 国際医療福祉大学, 基礎医学研究センター, 講師 (20598453) [Withdrawn]
岩田 卓 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (30296652)
河上 裕 国際医療福祉大学, 医学部, 教授 (50161287)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 免疫チェックポイント阻害剤 / シングルセル解析 / Tステムセルメモリー細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
免疫チェックポイント阻害剤応答性細胞集団に発現する新規機能分子の解析を目的として、悪性黒色腫および肺がんにおいて、抗PD-1抗体投与患者の末梢血サンプルを用いて、シングルセルRNAシークエンス解析を実施し、免疫チェックポイント阻害剤応答性細胞集団の解析や、当該細胞集団に発現する因子の解析を行っている。悪性黒色腫では、末梢血中CD8陽性T細胞においてSMART-seq解析を、肺がんでは末梢血単核球を対象にCITE-seq解析を行い、in silico解析を実施している。悪性黒色腫では、抗PD-1抗体奏効患者治療前末梢血中CD8陽性T細胞に存在するTSCM（T memory stem cells）様細胞集団の発現頻度が、治療効果と相関することを見出した。そこで、TSCM様細胞集団に発現する複数の遺伝子に着目して解析を行うことにした。それらのうちTSCMのマーカーの一つとして知られるTCF7との発現相関がTSCM中で高いNELL2に最初に着目し、CD8陽性T細胞での機能解析を行うことにした。当該機能解析のために、独自にNELL2ノックアウトマウスを、ゲノム編集技術を用いて作出した。最初に、NELL2ノックアウトマウスCD８陽性T細胞の遺伝子発現解析を行い、その機能解明を試みている。さらに、NELL2ノックアウトマウスとOT-１マウス（OVA-TCR 発現）の交配を行い、B16-OVA細胞に対する抗原特異的CD８陽性T細胞の有する細胞傷害性能へのNELL2の寄与の検証等を行っている。NELL2ノックアウトマウスを用いた、NELL2機能解析を行うとともに、NELL2以外のTSCM様細胞集団に発現する液性因子にも着目して解析を行うことにした。それら因子の抗PD-1抗体効果予測バイオマーカーとしての意義等を検証する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
悪性黒色腫および肺がん抗PD-1抗体投与患者末梢血サンプルを用いたシングルセルRNAシークエンス解析を実施した。悪性黒色腫ではCD8陽性T細胞のみを対象として解析を行ったが、肺がんでは末梢血単核球すべてを対象として、CITE-seq解析をTCRレパトア解析とともに実施した。独自に作出したNELL2ノックアウトマウスCD8陽性T細胞の遺伝子発現解析により、NELL2がTSCM（T memory stem cells）関連遺伝子の発現と相関していることが明らかとなった。一方で、OT-1細胞にNELL2をレトロウィルスで過剰発現させ、そのB１６-OVA細胞に対する細胞障害性をin vitroで調べたところ、細胞傷害能の亢進が認めらた。NELL2KO・OT-1マウスを用いても、T細胞の細胞傷害能に対するNELL2の寄与を検証している。これらとは別に、ヒトMART-１抗原認識T細胞を用いたin vitro細胞傷害能アッセイにおいても機能評価を行っている。In silicoデータ解析によると、ヒト肺がん腫瘍浸潤T細胞において、NELL2が活性化CD8陽性T細胞においても発現していることが認めれた。これらのことから、NELL2が多様な機能をT細胞で持つ可能性が生じた。そこで、NELL2ノックアウトマウスを用いて、さらなる詳細な検証を計画している(ノックアウトマウスにおけるがん細胞移植実験など)。これらとは別に、TSCMに発現する液性因子に着目し、ELISA系を確立して、肺がん等での抗PD-1抗体効果予測バイオマーカーとしての意義を検証している。CITE-seq解析により、CD4陽性T細胞中に、抗PD-1抗体の奏効と相関する細胞集団を新たに見出したために、それら細胞集団に特異的に発現する因子の性状解析に着手した。ただし、NELL2KOマウスコロニー拡大に時間を要し、進捗が遅れ気味である。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）in vitroにおけるNELL2の機能解析。ヒトおよびマススCD8陽性T細胞を用いた抗原特異的細胞傷害性モデルを用いて（MART-１ TCR-T, OT-１, CAR-T系）、T細胞にNELL2を遺伝子工学的手法で過剰もしくは抑制発現させ、その細胞障害能への寄与度を評価する。
２）NELL2 KO・OT-1 マウスの脾臓・リンパ節よりT細胞を回収したのち、B16-OVA細胞に対する細胞傷害性を検証する。また、B16-OVA細胞担がんマウスモデルにおいて、NELL2 KO・OT-1 マウス CD8陽性T細胞(もしくはNELL2過剰発現OT-1細胞)の養子免疫療法を行う。NELL2 KOマウスにおける、NELL2の機能解析をCD8陽性T細胞でより詳細に行うとともに、NELL2 KOマウスにMC38マウスがん細胞を移植し、腫瘍形成能を野生型マウと比較し、システミックなNELL2の抗腫瘍効果を検証する。
３）ヒトTSCMに発現する分泌蛋白に着目し、肺がん抗PD-1抗体投与患者の血液でELISAを行い、その抗PD-1抗体奏効予測バイオマーカーとしての意義を検証する（追加検体での検証）。必要に応じて、新規測定系を構築する。
４）肺がんにおいて、抗PD-1抗体治療奏効患者に相関して発現するCD4陽性T細胞集団（あらたに、CITE-seqで同定）に特異的に発現する分子群の性状・機能解析に着手する。また、それらのバイオマーカーとしての意義も検証する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍期に研究開始初年度が該当するとともに、所属研究機関移動等により、遺伝子改変マウスの施設間移動、およびマウスコロニー拡大に想定外の時間を要し、計画全体の進捗に影響を及ぼしている。コロナ禍中は、研究機関での研究活動制限も生じた。また、コロナ禍ピーク時には、必要な研究試薬・資材の入手に遅延も生じた。これらの研究開始時からの、想定外の研究の遅延が、研究最終年にも影響を及ぼしている。研究延長最終年度では、マウス飼育に関する費用や必要な抗体・分子生物学試薬等を購入する予定である。
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[Presentation] Cancer derived blood EVs potential predictive biomarkers for NSCLC patients treated with anti-PD-1 antibody2024
Author(s)
Ohta S, Kinoshita T, Wakui S, Maeda C, Hayahsi Y, Misawa A, Satomi R, Ikemura S, Soezima K, Yaguchi T, Kagamu K, Kawakami Y
Organizer
The 1st international Symposium on Cancer Immunology and Immunotherapy
Int'l Joint Research
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[Presentation] Cancer derived plasma exosomes are potential predictive biomarkers for NSCLC patients treated with anti-PD-1 antibod2023
Author(s)
Ohta S, Kinoshita T, Wakui S, Maeda C, Hayahsi Y, Misawa A, Satomi R, Ikemura S, Soezima K, Yaguchi T, Kagamu K, Kawakami Y
Organizer
第82回日本癌学会学術総会
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[Presentation] Cancer derived blood exosomes are potential predictive biomarkers for NSCLC patients treated with anti-PD-1 antibody2023
Author(s)
Ohta S, Kinoshita T, Wakui S, Maeda C, Hayahsi Y, Misawa A, Satomi R, Ikemura S, Soezima K, Yaguchi T, Kagamu K, Kawakami Y
Organizer
2nd JCA-AACR Precision Cancer Medicine International Conference
Int'l Joint Research
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