2022 Fiscal Year Research-status Report
Functional assay to estimate the significance of variants in CDKN2A gene detected in cancer genome testing
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21K07248
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| Research Institution | Tohoku Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
下平 秀樹 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (70373214)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | CDKN2A / バリアント |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はCDKN2A遺伝子のバリアントを作成し、機能評価系を構築しがんゲノム医療における意義不明バリアントの解釈に役立つ情報を集積することにある。健常人のリンパ球からmRNAを抽出し、RT-PCRにより増幅したCDKN2A cDNAをベクターに組み込み、サンガーシークエンスにて、配列を確認するした。増幅した断片をBamHIとNotIにより切断し、ヒト細胞株用のＣMVベクターであるpcDNA3.1に挿入した。サンガーシークエンスは外部委託により行い正常配列であることを確認した。そのフラグメントを, 出芽酵母用のpRS315, ヒト細胞株用のエピソーマルベクターであるpCAGs-MCSに移した。部位特異的バリアント導入は出芽酵母の細胞内で行い、実際の機能評価は細胞株でエピソーマルプラスミドを用いて行う。部位特異的バリアント導入のためには、ギャップベクターが必要であり、インバースPCRのためのプライマーを合成し、5’側、3’側を25bp程度残してcDNAの中心部分ほとんどを欠失したギャップベクターを作成した。ClinVarに登録されているCDKN2A cDNAのミスセンスバリアントは約600種類あったが、乳癌において報告されている15種類を優先して作成することとし、バリアントプライマーを発注し、PCR, メガプライマー精製、セカンドPCR, ギャップリペアー、酵母ミニプレップ、大腸菌ミニプレップ、サンガーシークエンスの手順で部位特異的バリアント導入を進めている。細胞株を用いた機能診断系の構築が最も重要な部分であるがRBのリン酸化状態やE2Fによる転写活性などを指標としたシステムの確立を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究はやや遅れ気味である。当研究室は病院業務を兼任する臨床系の教室であるがスタッフが3名しかおらず、診療や臨床実習などの教育を行うとかなり時間を取られるため、研究の時間が十分とれないのが問題である。東北医科薬科大学は医学部設立後、試行錯誤で診療、教育を進めている状況であったが、本年度以降ルーチン化して安定すると考えられる。今後はもう少し安定したエフォートの分配が可能と考えている。研究棟の必要物品や試薬はほぼ整備され、研究を推進する環境はほぼ出来上がってきたといえる。CDKN2A遺伝子の部位特異的バリアント導入に関しては軌道に乗りつつあり、解析のための材料は蓄積されてきている。
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| Strategy for Future Research Activity |
作成した野生型CDKN2A遺伝子発現プラスミドによるヒト細胞株でのCDKN2A遺伝子の発現が確認されていない。ヒト神経膠芽腫細胞U87MG細胞にエピゾーマルベクターに組み込んだ野生型CDKN2A遺伝子をトランスフェクションし、ウェスタンブロッティングにより発現を確認する。抗体がうまく機能しない場合は、HAタグをつけたcDNAを発現する方針に切り替える必要がある。また、野生型CDKN2A遺伝子を発現し、RBのリン酸化状態やE2Fによる転写活性などを指標とした機能評価系の構築を行う。並行して、CDKN2A遺伝子のギャップベクタ―およびバリアント導入プライマーによる増幅断片を出芽酵母に同時にトランスフェクションすることで、変異導入断片をプラスミドに導入する実験を行う。この2つの実験を同時に行うことで、研究の遅れを挽回する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた最大の理由は、実験の進捗が遅れたため、本年度は予想よりも使用額が少なかったことである。また、本研究に関しては、類似の内容で製薬会社の奨学寄附金に応募し、2件の助成金を得ていたため、本研究費を節約しながら研究を進めることが可能であった。
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