2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of disease-modifying therapy for spinocerebellar ataxia type 42 and elucidation of pathophysiological basis using optogenetic methods
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21K07298
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
土井 宏 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (10326035)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹内 英之 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (30362213)
田中 章景 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (30378012)
石川 太郎 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (50547916)
國井 美紗子 横浜市立大学, 医学研究科, 客員講師 (80725200)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | CACNA1G / 脊髄小脳変性症 / 光遺伝学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは研究対象としてきた常染色体優性脊髄小脳失調症（SCA）大家系において、新型DNAシーケンサーを用いて低電位活性化型のT型電位依存性カルシウムチャネル（VGCC）の一種であるCaV3.1をコードするCACNA1Gのミスセンスバリアント、p.Arg1715His（R1715H） を同定した。単一アミノ酸のミスセンスバリアントであるR1715Hにより実際に神経変性が惹起されるかは不明であり、申請者らはその証明には動物モデルの作成が必須であると考え、R1715Hと同等のR1723HバリアントをCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集により導入したノックインマウス（Cacna1g_R1723H_KIマウス）を作成した。これまでに申請者らは構造モデリング、ヒト病理検体解析、培養細胞実験を継続するとともにCacna1g_R1723H_KIマウスの多面的解析を行い、このバリアントによるタンパク質凝集性には変化がないこと、行動解析において患者と同様の緩徐進行性の失調症状を示すこと、プルキンエ細胞（PC）の進行性変性を呈すること、PCおよび下オリーブ核神経細胞がカル
シウム電流異常を含む電気生理学的異常を呈することを示し、SCA42の表現型を良好に再現するモデルを確立してきた。本研究ではCacna1g_R1723H_KIマウスにT型VGCC修飾薬の投与を行い、その効果を表現型解析、病理学的解析、RNA発現解析など多面的に検証することにより、新たな疾患修飾治療法を開発し疾患克服への道筋をつけること、また光遺伝学的手法を用いて神経変性の病態基盤をin vivoのレベルで解明することを目的としている。昨年度の時点で表現型解析、病理学的解析においてT型VGCC修飾薬の効果を認めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は下記のような計画のもと、おおむね順調に進展している。
①Cacna1g_R1723H_KIマウスにおけるVGCC機能修飾薬の治療効果の検討：疾患発症機序がgain-of-toxic-functionであるとの立場からはT型VGCC阻害薬で治療効果を検討している。現時点で50週齢まで野生型、ヘテロおよびホモノックインマウスにT型VGCC阻害薬を経口投与を終えRotarodテストで失調改善効果を認め、本年度は病理学的解析でも変性抑制効果を確認できたため、順調に進行している。
②Cacna1g_R1723H_KIマウスのRNA発現解析：50週齢のSCA42マウス（野生型、ヘテロ KI、ホモ KI）各3匹ずつの小脳からRNAを抽出し、網羅的に解析した。Log Fold ChangeとLog P. valueをもとに、発現変動遺伝子を検索しVolcano plotとHeatmapで可視化を行った。野生型と比して低下している発現遺伝子は、ヘテロKIで19個、ホモKIでは33個認められ、野生型と比して上昇しているものはヘテロKIで13個、ホモKIでは26個認められた。
③Cacna1g_R1723H_KIマウスのin vivo PCにおける電気生理学的解析と治療効果の検証：プルキンエ細胞特異的にチャネルロドプシン２（ChR2）を発現するトランスジェニックマウスとCacna1g_R1723H_KIを掛け合わせ、用いて、光照射によりプルキンエ細胞を簡易に同定できるモデルを採用した。現在、データ取得中である。ただし、ChR2発現のプルキンエ細胞特異性が悪い、という問題点が生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
①Cacna1g_R1723H_KIマウスにおけるVGCC機能修飾薬の治療効果の検討：T型VGCC阻害薬の単一濃度で研究を進めて行くことが妥当かどうかについて検証するため、ゾンデによるT型VGCC阻害薬の投与により、より血中濃度を高めた場合の効果について検討する予定である。
②Cacna1g_R1723H_KIマウスのRNA発現解析：今後より若年マウスのRNAシーケンスも検討する。
③Cacna1g_R1723H_KIマウスのin vivo PCにおける電気生理学的解析と治療効果の検証：現行のマウスでは、ChR2がプルキンエ細胞以外の細胞でも非特異的に発現している可能性が否定できない。より特異性の高いL7-Creマウスを入手できたため、今後はこの系統を使用する予定である。
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| Causes of Carryover |
本研究は①Cacna1g_R1723H_KIマウスにおけるVGCC機能修飾薬の治療効果の検討、②Cacna1g_R1723H_KIマウスのRNA発現解析、③Cacna1g_R1723H_KIマウスのin vivo PCにおける電気生理学的解析と治療効果の検証を行っておりおおむね順調に進捗している。しかしマウス管理費が想定よりも少なかったため、次年度使用額が生じた。次年度以降①、③の進捗に伴いマウス管理費の増大が見込まれること、また②で若年マウスのRNAシーケンス解析を行うため、当該費用を使用する予定である。
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