2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of novel therapy for thrombosis induced by neutrophil extracellular traps
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21K07331
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| Research Institution | Himeji Dokkyo University |
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Principal Investigator |
通山 由美 姫路獨協大学, 薬学部, 教授 (70362770)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 好中球 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、好中球のNETs(Neutrophil extracellular traps)を契機とする血栓形成の分子機構を解明して、血栓症の新規治療法を開発することである。NETsは、好中球のクロマチンが網状構造に変化して、病原体を捕捉する感染防御システムである。近年、NETsが血小板や血液凝固カスケードを刺激して、血栓症を誘発することが注目されている。そこで本研究では、NETs形成に重要な分子と化学反応を見いだし、その制御を通して血栓症の新規治療法を開発する事をめざす。
昨年度に引き続き、S100A8、S100A9についての解析を進めた。S100A8、S100A9は共に、プロテインS100ファミリーに属するカルシウム結合タンパク質である。以前に実施した質量分析の結果より、好中球のNETs形成過程で化学修飾を受ける重要なタンパク質として注目している。
S100A8、S100A9それぞれのノックアウト型好中球モデルを作成し、野生型と比較して、mRNAの発現量が有意に変化する遺伝子群をGSEA解析により探索した。
１）S100A8ノックアウト細胞と野生型、２）S100A9ノックアウト細胞と野生型の比較をおこなったところ、両解析において、概ね同様の結果が認められた。ウエスタンブロッティング法による解析において、S100A8のノックアウトでS100A9の発現が、S100A9のノックアウトでS100A8の発現が抑制される事をすでに確認しており、両分子がmRNAレベルで、互いに発現を調節していることが示唆された。
引き続き、S100A8、S100A9のノックアウトによりmRNAが有意に上昇する遺伝子群と、減少する遺伝子群、それぞれについて、タンパク質レベルでの発現への影響を検証するとともに、好中球のNETs形成、および好中球の機能に与える影響について解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NETs形成に重要なタンパク質として注目しているS100A8とS100A9について、網羅的なmRNAの発現分析をおこなった結果、それぞれのノックアウトにより、mRNAが有意に減少する遺伝子群と有意に上昇する遺伝子群を複数見いだした。S100A8、S100A9の下流シグナル分子として解析を進めており、全体としては概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、NETs形成に重要な化学反応を探索して、その制御を通して血栓症の新規治療法の開発をめざす。
好中球のNETs形成に重要なタンパク質として注目しているS100A8とS100A9については、網羅的なmRNA測定のGSEA解析の結果をさらに分析する。とりわけ、１）S100A8、S100A9のノックアウトにより、mRNAが有意に減少することを見いだした遺伝子群についての解析を進める。遺伝子群の中で、特に減少の著しい遺伝子について、ウエスタンブロッティング法にてタンパク質レベルでの影響を検証して、差異のある分子を同定する。同定したタンパク質について、NETs形成プロセスへの影響を、可視的、生化学的な方法で検討する。加えて、NETs放出成分の解析、食作用や活性酸素産生への影響、ウイルス感染時のサイトカイン産生などについて、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡による可視的な手法、生化学的な手法で解析する。一方で、２）S100A8、S100A9のノックアウトによりmRNAの発現量が上昇したタンパク質については、NETs形成を抑制制御する活性も含めて、新たな視点で分子機能を探索する。
さらに、S100A8、S100A9以外のNETs形成に関わる分子候補として、P4HB（ジスルフィドイソメラーゼ）とRab27A（低分子量GTPアーゼ）についての解析も進める。ノックアウト型好中球モデル細胞を活用して、分葉核の形態への影響、NETs形成プロセスやNETs放出成分、ケモカイン依存性の遊走への影響など、NETs形成への関与について検討する。
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| Causes of Carryover |
当初は初年度に、新たな刺激でヒト好中球にNETsを誘導して質量分析を実施する計画であったが、以前に実施した網羅的質量分析の結果を再検討し、翻訳後修飾の経時的変化に注目して再度分析した。視点を変えることで、新規に注目すべき分子を見いだすことができたので、質量分析の再実施を見送った。
さらに今年度についても、既存の試薬を有効に活用して新規標的分子の遺伝子編集に取り組むことができたため、次年度使用額が生じた。
今年度の取り組みで、NETs形成に関わる新たな候補分子として、S100A8、S100A9のノックアウトで有意に発現量が減少するタンパク質を複数見いだしており、これらの分子機能の解明に有効に活用する。
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