2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of high-sensitivity detection technology for nucleic acid amplification using metal and metal chelator and verification of its practicality
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21K07340
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
外園 栄作 九州大学, 医学研究院, 講師 (60404042)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
内海 健 九州大学, 医学研究院, 教授 (80253798)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 金属キレータ / 核酸増幅 / 高感度検出 / ピロリン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在，ウイルスや細菌の検出，また，癌やその他の疾患の潜在的なバイオマーカーとして生体内で循環するmiRNAなどの核酸に着目した検査が臨床において用いられおり，今後さらにその需要が高まると予想される。
核酸を用いた検査には，目的とする遺伝子の増幅が不可欠であり，これまでにもいろいろな増幅技術が開発され実用化されてきた。一方，増幅の程度を検出する技術においては，その多くが蛍光を標識した高価なプローブを用いた検出法であることから，励起装置や蛍光を検出する特別な機器が必須となる。
そこで，本研究では，核酸の増幅時に副二次的に生成されるピロリン酸に着目し，酵素を用いてこのピロリン酸を低価格で高感度に検出することで，特別な機器や分析環境条件を問わない，かつ，目視にて検出可能な，より簡便な核酸増幅量の検出技術と核酸定量の開発を試み，本法の技術応用の可能性について探索・検証を行うこととする。
本年度は、核酸増幅時の生成物であるピロリン酸検出の基本的な反応系の構築を行った。初発酵素の反応条件が厳しく、思うような反応を引き出すのが難しかったが、緩衝液のpH、種類等を検討した結果、水溶液ベースにおける反応系を構築する事ができた。検出感度は良好であ理、また、実際に核酸増幅後の試料を用いた検討においても、核酸増幅を検出できた。しかし、水溶液ベースと比較して何らかの反応の阻害が起きていることが判明した。今後は、この物質の特定と影響の回避策について検討を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
核酸増幅時の生成物であるピロリン酸検出の基本的な反応系の構築を行い、水溶液ベースにおける検出感度は予定していたものよりも高感度に反応系を構築ができ、良好である。また、低濃度域での直線性も良好である。
また、実際に核酸増幅後の試料を用いた検討においても、核酸増幅を検出・確認することできた。このことは予定より少し早いペースで課題が進んでいると考えている。しかし、実際に核酸増幅後の試料を用いた場合においては、水溶液ベースと比較して何らかの反応の阻害が起きていることも判明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、反応妨害物質の特定と影響の回避策について検討を進める予定である。現段階での阻害物質の候補としては、核酸増幅に使用されるいずれかの成分が、本反応系を阻害していることから、本法へ増幅試薬を一つづつ添加していくことで、その影響の有無について検証をこなう予定である。
また、次年度は増幅させるサイクル数などを含め検出時間についても現行法と比較する予定である。
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