Functional analysis of bacterial cellulose synthesis to overcome biofilm infections

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07355
• Research Institution: Nihon institute of Medical Science
• Principal Investigator: 菅原 佳奈子 日本医療科学大学, 保健医療学部, 助教 (00551087)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: セルロース合成酵素 / バイオフィルム / 膜タンパク質 / 複合体タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、感染症の難治化の要因であるバイオフィルムの合成機序を明らかにするため、バイオフィルムの主成分であるバクテリアセルロース（BC）の合成機構の解明に取り組んでいる。BCは細菌の細胞膜上に存在するセルロース合成酵素複合体（TC）によって合成されている。本研究ではBC合成機構の中でも特に、（１）合成されたセルロース鎖を菌体外へ排出すると推測されるBcsCサブユニットの立体構造（２）内膜のBcsABによって合成されたセルロース鎖がどのように外膜のBcsCに受け渡され、菌体外へ導かれるのか、の2点に注目して研究を進めている。
まず上記（１）について、BcsCの単離精製のため、TCを構成する主要なサブユニットにタンパク質精製用のアフィニティタグを挿入し、BcsCの精製を行った。
次に（２）について、TCにはBCの合成や輸送においてメインに機能するサブユニットの他に、機能不明のアクセサリーサブユニットが存在しており、これらがBcsABとBcsCの結合に関与する可能性が高いと考えた。そこでアクセサリーサブユニットであるBcsD、Ccp、CMCaseの3つのタンパク質を組換え発現し、これらのタンパク質同士が会合して複合体を形成するかどうかクロマトグラフィーで確認した。その結果、BcsDとCcpの組み合わせで分子質量の大きい複合体の形成が示された。さらに、主要なサブユニットであるBcsABおよびBcsCに対しても組換え発現による会合状態の確認を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究実績の概要で述べたように、本研究は、（１）合成されたセルロース鎖を菌体外へ排出すると推測されるBcsCサブユニットの立体構造、（２）内膜のBcsABによって合成されたセルロース鎖がどのように外膜のBcsCに受け渡され、菌体外へ導かれるのか、の２点を明らかにする。
（１）については進捗が遅れている。研究代表者の所属変更のため、主な研究実施場所である所属大学に膜タンパク質の精製に必須である超遠心機が配備されていない。そのため共同研究先に配備されている超遠心機を使用していたが故障し、更新の目途が立っていない。現在、借用できる施設を当たっているが、タンパク質の精製を一時的に中止せざるを得ず、研究計画全体として遅れを生じている。現在、超遠心機を借用できる施設を当たっている。そこで現在は（２）に関する研究を中心に進めている。内膜に埋め込まれた合成酵素であるBcsABから、外膜に埋め込まれた輸送装置であるBcsCまでセルロースが受け渡される機構を明らかにするため、複数のサブユニットで構成されるTCの、サブユニット間の位置関係をされたまた、セルロース合成酵素のサブユニットに対する抗体の作製に取り組んでいる。

Strategy for Future Research Activity

（１）BcsCの立体構造の解明については、BcsCの精製のためにアフィニティタグを酢酸菌ゲノムに挿入した。酢酸菌におけるTCの発現量が少ないこと、BcsCが膜タンパク質であるために抽出に界面活性剤が必要であることから、構造解析のための結晶作製に十分な収量を得られていない。そのため、TCを高発現する酢酸菌の培養条件を検討すると共に、できる限り大量に培養して十分な収量を得ることを目指す。
（２）セルロース鎖排出機構の解明については、これまでの成果により免疫沈降による相互作用解析に必要な感度、特異性を持つTCサブユニットの抗体を得られた。また、各サブユニットの免疫沈降条件を確立した。今後は各サブユニットの抗体を用いた免疫沈降により、サブユニットと相互作用するタンパク質の候補を捕捉する。これらの候補タンパク質を抗体を用いて同定する。抗体のないタンパク質（TCサブユニットでないタンパク質）に対しては、アミノ酸シークエンスあるいは質量分析による解析を行う。

Causes of Carryover

セルロース合成酵素複合体（TC）は膜タンパク質複合体であるため、細胞からの膜画分の調製が必須である。膜画分は、細胞を破砕し、細胞核などの通常の遠心速度で沈殿するものを除いた上清に対して超遠心を行った沈殿として得られる。従って、膜画分を多量に調製するためには大型の超遠心機が必要である。しかしながら、主な研究実施場所には超遠心機が配備しておらず、超遠心を必要とする場合には共同研究先に細胞破砕液を持参して行っている状況である。当初計画した際の主な研究実施場所には超遠心機が配備されていたため、当初の予定に比較して進捗が遅れている。この影響を受け、まだ作製が完了していない抗体があり、次年度物品費として繰り越しを行った。また、令和５年度は新型コロナウイルス感染症が５類に移行したことを受け、マスクなどの感染予防策や濃厚接触者の自宅待機が任意になった。結果として数年間流行のなかったインフルエンザなど他のウイルスが大規模に流行し、大学では例のない学級閉鎖を行う事態もあった。休講となった授業の補講が求められ、学会出張が取りやめになったため、旅費を使用しなかった。また、論文の投稿も遅れているため、論文校閲費、投稿費などを繰り越している。