2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of analytical kit for causative agent to cause licorice-induced pseudoaldosteronism
| Project/Area Number |
21K07357
|
|---|
| Research Institution | Daiichi University, College of Pharmaceutical Sciences |
|---|
Principal Investigator |
森永 紀 第一薬科大学, 薬学部, 教授 (60465771)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
牧野 利明 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 教授 (80326561)
小川 鶴洋 第一薬科大学, 薬学部, 講師 (40781646)
大磯 茂 長崎国際大学, 薬学部, 教授 (40513106)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 偽アルドステロン症 / 漢方薬 / 甘草 / 硫酸抱合体 / モノクローナル抗体 / ELISA |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
偽アルドステロン症 (PAism)の原因物質はこれまで3-monoglucuronyl glycyrrhetinic acid (3MGA)によるものと考えられてきた. しかし、近年の3MGAに対するモノクローナル抗体(MAb)を用いた動物実験及びヒト血清サンプルの分析で, glycyrrhetinic acid (GA)の硫酸抱合体である18β-glycy-rrhetyl-3-O-sulfate(GA3S)が原因物質の可能性が高いことが報告されている.
抗3MGA MAbはGA誘導体に交差反応性を示すため、より特異的にGA3Sを認識するMAbの作製が望まれており, そのMAbを用いればPAism発症予測用検査キットの開発にも応用できる可能性がある.
本研究では, GA3Sコンジュゲート(GA3S-Conj)を用いて免疫処置したマウスの血清を用いた競合的ELISA法でGA3Sを特異的に認識する抗体が分泌されるかを調査した.
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
GA3Sとキャリアタンパク質(CP)であるKLH及びHSAはカルボジイミド法を用いてGA3S-Conjを調製した. GA3S-KLHを免疫原として初回はフロイント完全アジュバント, 二回目はフロイント不完全アジュバントとともにBalb/c雌性マウスに腹腔内投与した. その後二週間おきにGA3S-KLHを腹腔内投与した. 免疫処置マウス尾静脈より採血して血清を用いて、競合的ELISA法で抗GA3S抗体が分泌されているかを検討し、GA3Sに特異的な抗体の誘導をマウス血清で確認出来たが、細胞融合が未実施であり、モノクローナル抗体作製が完結していないので、やや遅れている理由であr。
|
| Strategy for Future Research Activity |
12次免疫後のマウス血清を用いてGA3S-Conj, HSA, BSA, KLHを固相化抗原とした場合の反応性を間接ELISA法で確認した. その結果, GA3S-KLHで最も吸光度が高く, 次いでGA3S-HSA, KLH, HSA, BSAと続いた. KLHの吸光度はGA3S-KLHの約0.5倍であったので, 抗体認識部位がGA3S-KLHのGA3S部か, KLH部かを判断できなかった.
一方で, HSAの吸光度はGA3S-HSAの約0.1倍であったので, GA3S-HSAを固相化抗原に用いた. GA3S, 3MGA, glycyrrhizin (GL), cholesterol (CH), corticosterone (CR)について競合的ELISA法で分析したところ, 50 μg/mL GA3Sと競合させた際に約90%の阻害率を示した.
一方で、GLや3MGAと競合させた際の阻害率はそれぞれ約6%, 3%であり、GA誘導体が複数存在する条件でも選択的にGA3Sを認識できる可能性が示唆された.
また, CHでは阻害は観察されなかったが, CRでは約16%の阻害率が観察された. CRがGA3Sと同一の抗体に認識されるかは現時点では明らかではないが, 今後のMAb作製における検討で抗体の性質および, CRに対する反応性に関しても明らかにし、簡易分析キットの作成のためのモノクローナル抗体の作製を急務としている。その後は、本抗体を用いた分析キットの開発を進める計画である。
|
| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は、モノクローナル抗体作製のための細胞融合を実施出来ず、次年度は細胞培養のプラスチック器機や抗体精製カラム、分析キット開発のための機材に使用を計画している。
|
