Identification and clinical usefulness of biomarkers for treatment option of multiple myeloma

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07405
• Research Institution: Daiichi University, College of Pharmaceutical Sciences
• Principal Investigator: 炬口 真理子 第一薬科大学, 薬学部, 教授 (10379430)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 角山 圭一 姫路獨協大学, 薬学部, 准教授 (70454767)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: バイオマーカー / 多発性骨髄腫 / 免疫調整薬(IMiDs) / セレブロン / ユビキチン結合酵素

Outline of Annual Research Achievements

多発性骨髄腫(MM)患者の初回標準治療は、ダラツムマブにプロテアソーム阻害剤のボルテゾミブか免疫調整薬(IMiDs)のレナリドミドの何れかを併用するが、両者を選択するためのバイオマーカーはない。我々はこれまで、ボルテゾミブのバイオマーカーとしてユビキチン結合酵素(E2)であるUbcH8を報告した。今回、レナリドミドのバイオマーカーを探索し、有用性を検証することを目的とした。生体内の蛋白質品質管理機構の一つにユビキチン-プロテアソーム系がある。ユビキチン化にはユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2)及びユビキチンリガーゼ(E3)の3つの酵素が必要であり、これらは蛋白質固有である。IMiDsはE3複合体CRL4(DDB1-Cul4-Roc1-CRBN)の基質結合サブユニットであるセレブロン(CRBN)に結合して基質蛋白のプロテアソームでの分解を制御することが報告されているので、最初にCRBNのE2を探索する実験を行った。
1. MM細胞株にレナリドミドを添加して、生存率、増殖能の低下を確認した。
2. IMiDsは、転写因子であるIkaros及びAiolosをユビキチン化し、分解へ誘導することが報告されているので、IMiDs添加による発現量の変化を調べたところ、IMiDs濃度依存的にIkaros、Aiolosは低下した。
3. IMiDsは細胞株に対し抗腫瘍効果を示し、CRBNを介してIkaros、Aiolosをプロテアソームで分解することが示されたので、このときの特異的E2を探索することとした。当初、Trypsin Resistant Tandem Ubiquitin-binding Entity法を用いて、CRBNの基質を探索する計画であったが、基質をIkaros、Aiolosに定めてE2 scan Kit(Ubiquigent社)を用いてE2を探索することにした。方法は、34種類×2のE2が含まれている96wellプレートにE1とユビキチン、CRBN、レナリドミド、Ikarosを添加して、ユビキチン化されたE2をウエスタンブロット法により調べた。
現時点では、この実験により目的E2が同定されていない。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

免疫調整薬(IMiDs)が結合するユビキチンリガーゼ(E3)であるセレブロンに特異的なユビキチン結合酵素(E2)の同定に時間を要しているため、遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

・IMidsによりプロテアソームで分解誘導されるIkarosのE2の同定をE2 scan Kit(Ubiquigent社)にて再度行う。このkitは34種類のE2を同定するものであり、同定できない場合は、残りの6種類のE2(E2は40種類)について、個々にユビキチン化反応を行うことにより調べる。
・IkarosのE2が同定された場合、次に、同定されたE2がAiolosにおいてもユビキチン化を誘導するかどうかを調べ、目的のE2であることを確認する。
・E2同定後、IMidsの濃度によるE2発現量の変化を調べて、バイオマーカーとして有用であるかを検討する。

Causes of Carryover

理由
実験が遅れているため
使用計画
研究費の大部分はE2同定のための解析試薬および物品の購入に使用する予定である。