Identification and clinical usefulness of biomarkers for treatment option of multiple myeloma

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07405
• Research Institution: Daiichi University, College of Pharmaceutical Sciences
• Principal Investigator: 炬口 真理子 第一薬科大学, 薬学部, 教授 (10379430)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 角山 圭一 姫路獨協大学, 薬学部, 准教授 (70454767)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 多発性骨髄腫 / レナリドミド / バイオマーカー / セレブロン / ユビキチン結合酵素

Outline of Annual Research Achievements

2021年度、レナリドミドは、E3複合体CRL4(DDB1-Cul4-Roc1-CRBN)のセレブロン(CRBN)に結合して基質蛋白Ikaros及びAiolosのプロテアソームでの分解を誘導することを確認した。次にIkaros、Aiolosの特異的E2をバイオマーカー候補とするにあたり、Trypsin Resistant Tandem Ubiquitin-binding Entity法を用いて特異的E2探索したが同定できなかった。
2022年度、新たにE2 scan Kit(Ubiquigent社)を用いてE2探索を試みた。E3複合体CRL4と基質Ikarosを34種のE2酵素とそれぞれ反応させウエスタンブロット(WB)法によりIkarosの特異的E2を調べたところ、数種 (UBE2D1、2D2、2D3、2E1、2G1など)のE2と反応し、非特異反応を除外することができなかった。また再現性もとれてなかった。Aiolosについても同様の結果であり、Ikaros、Aiolosの特異的E2が同定されなかった。
2023年度、IkarosのE2候補をUBE2D1、2D2、2D3、2E1、2E3、2G1、2I、2L6に限定して実験を行った。MM細胞株KMS-11にレナリドミドとプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブを添加したところ、レナリドミド濃度依存的にユビキチン化Ikarosは増加していた。我々はこれまで、ボルテゾミブによりユビキチン化E2が増加することを実証しているので、IkarosのE2候補UBE2D1、2D2、2D3、2E1、2E3、2G1、2I、2L6の各々について、免疫沈降(IP)法を用いてE2およびユビキチン化E2を測定したところ、ユビキチン化UBE2G1が他に比べて増加していた。以上の結果から、UBE2G1がレナリドミド添加時に作用するE2ではないかと考えた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

当初の計画では、免疫調整薬(IMiDs)が結合するユビキチンリガーゼ(E3)であるセレブロンの特異的ユビキチン結合酵素(E2)をTrypsin Resistant Tandem Ubiquitin-binding Entity法またはE2検出kitを用いて同定することを目指していたが、同定できなかったため、候補として上がった8種のE2についてユビキチン化反応を検討することにしたが、未だ全種について検討できていない。

Strategy for Future Research Activity

実験が当初の予定通りに進まず、延長することとなった。
レナリドミドによりプロテアソームで分解誘導されるIkarosのE2を8種類に絞って、ユビキチン化反応およびE2発現量の変化などを比較することにより、特定のE2がバイオマーカーとして有用であるかを検討する。

Causes of Carryover

理由
実験が遅れているため
使用計画
ユビキチン化酵素、各種抗体など試薬の購入に使用する予定である。