2021 Fiscal Year Research-status Report
血清グライコミクスを用いた糖鎖腫瘍マーカーの同定と多項目同時診断システムの構築
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21K07409
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| Research Institution | Osaka International Cancer Institute |
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Principal Investigator |
岡本 三紀 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所), その他部局等, 分子生物学部主任研究員 (20332455)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 腫瘍マーカー / 糖鎖 / HPLC / 質量分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血清中のほとんどのタンパク質は糖鎖修飾を受け、その糖鎖は結合様式の異なるN型糖鎖とO型糖鎖の2種類に分類される。これらの糖鎖構造のうち、sialyl Lewis Aと呼ばれる4糖はCA19-9として知られる腫瘍マーカーで、臨床現場で広く利用されている。本研究は、HPLC-basedグライコミクス解析により従来法では検出されなかった腫瘍マーカーを新たに検出し、複数マーカーを用いた質量分析による新たながん診断システムの開発を目指している。がん患者および健常人のHPLC糖鎖プロファイルを作成するために、血清糖たんぱく質から切り出した糖鎖を蛍光標識し、多段階HPLCで溶出分離する。N型糖鎖の解析にはその切断酵素PNGase Fがよく用いられる。一方、O型糖鎖は切り出す酵素がないため、化学的に切断する方法が利用されるが、同時に多量のN型糖鎖も切り出されてしまう。順相HPLCではN型糖鎖と伸長したO型糖鎖の溶出位置が重なり、圧倒的に量の多いN型糖鎖に埋もれて検出が難しい。そこで全てのO型糖鎖を検討対象とするため、血清N型糖鎖を先に酵素で切り出し分離してから、O型糖鎖を抽出精製する方法の検討を行った。血清をrapid PNGase Fで反応させた後、糖タンパク質と遊離N型糖鎖を分離し、糖タンパク質からO型糖鎖を遊離させた。検討項目として、O型糖鎖の抽出方法とピーリング産物の抑制、PNGaseによるN型糖鎖の回収率、PNGaseの反応液の条件検討、遊離N型糖鎖と糖タンパク質の分離方法を確認した。また、質量分析を用いた多項目同時測定は、尿検体から抽出したPA化糖鎖mixtureを用い、複数糖鎖構造の同時測定を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、①HPLC-basedグライコミクス解析に基づいた、がん患者血清中の新規腫瘍マーカー探索と、②同定した腫瘍マーカー候補を含めた多項目腫瘍マーカー同時測定方法の確立を計画としている。HPLC-basedグライコミクス解析では、血清中の糖タンパク質から糖鎖を切り出し、蛍光標識した糖鎖のHPLCによる溶出パターンを健常人とがん患者で比較することで腫瘍マーカー候補を同定する。N型糖鎖とO型糖鎖の全てをそれぞれ分離して回収するために、糖鎖の回収方法の確立を検討した。O型糖鎖は化学的に遊離する方法のうち、水酸化リチウムとヒドラジンによる糖鎖の切り出しを行い、その後糖鎖回収率を比較した。またピーリングを抑制するため、ヒドロキシルアミンやマロン酸を添加した。N型糖鎖はrapid PNGase Fとヒドラジン分解による切り出しの比較を行うと同時に、酵素反応液の検討も行った。分離手順は最初にrapid PNGase FでN型糖鎖を切断し、その後ヒドラジン分解を行うことでN型糖鎖とO型糖鎖を完全に分離するが、回収したO型糖鎖にN型糖鎖が混ざり完全な分離は達成できていない。N型糖鎖の混入を減少させるため、分離方法を最適化する必要があり検討中である。一方、質量分析を用いた多項目同時測定方法の確立は、尿サンプルから抽出したPA化糖鎖を用いて、内部標準1つを加えて計7種類の糖鎖構造の同時測定を達成している。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在検討中である血清O型糖鎖およびN型糖鎖の完全な分離回収を確立する。糖鎖遊離方法が確定後、がん患者血清と健常者検体から糖鎖を調整する。対象とするがんは、従来の方法ではがん抗原を検出できず、有用な腫瘍マーカーを欠いていると考えられているがんに絞る。これまで当研究室では胃がん検体を多く解析してきたが、ほとんどが腺がんである。そこでやはり有用なマーカーの無いスキルス胃がんを対象にマーカー探索をスタートする。血清O型糖鎖のプロファイリングを行い、同時に検体調整を行う健常人との溶出パターンを比較する。血清O型糖鎖の結果を検討後、必要ならN型糖鎖解析あるいは尿検体からの遊離糖鎖解析など有用なマーカー候補が欠いた場合の対応も考慮済みである。同時に希少がんで腫瘍マーカーの乏しい肉腫などの検体回収も始める予定である。
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| Causes of Carryover |
当初の研究実施計画では糖鎖調整試薬及びHPLC/MS消耗品に使用する予定であったが、他の研究費から購入した消耗品で賄った。また論文投稿準備に時間を割いたため、予定の消耗品購入が減った。今年度は研究試薬およびカラムなどの消耗品の購入に加え、論文投稿費の支払いに使用する。
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Research Products
(6 results)
