2022 Fiscal Year Research-status Report

Targeting basal autophagy as therapeutic drugs in neurodegenerative diseases

Research Project

Project/Area Number	21K07422
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	渡邊義久京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	田口勝敏京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60462701)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	オートファジー / 神経変性疾患 / Beclin1 / Rubicon / UVRAG
Outline of Annual Research Achievements	Becin1複合体形成を指標としたBasal Autophagy活性の測定システムの開発のために、スプリット発光タンパク質NanoBitを利用しタンパク質-タンパク質相互作用解析を行った。HEK293細胞にLgBiT-Beclin1とSmBiT-UVRAG、LgBiT-Beclin1とSmBiT-Rubicon、LgBiT-Beclin1とSmBiT（ネガティブコントロール）の組み合わせで一過的に遺伝子導入を行った。一晩培養した後、発光基質Nano-Glo Live Cell Substrateを加え、マルチモードプレートリーダーGloMaxで発行測定を行った。その結果、すべての組み合わせで発光が認められ、ネガティブコントロールとして使用したLgBiT-Beclin1とSmBiTの組み合わせでも高い発光量であった。従って、本システムではベースの値が高いため目的タンパク質の相互作用を測定するのが非常に困難であった。この問題を解決するために、一過的発現ではなく安定発現株を作製し相互作用解析を行う。現在、本ベクターに薬剤耐性マーカーを導入している。また、コントロールとして使用するATG7_KOおよびRubicon_KO細胞をCRISPR/Cas9で作製した。これらの細胞も利用しオートファジー活性を測定する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 構築したシステムのネガティブコントロールでも活性が高かったため改良が必要となった。
Strategy for Future Research Activity	構築したベクターで安定発現株を作製するために、薬剤耐性遺伝子を導入する。そして、これらの細胞で相互作用の測定を行う。また、ATG7_KOやRubicon_KO細胞を作製したので、これらの細胞でも同様に安定発現株を作製し、オートファジー活性と相互作用活性の相関を確認する。